正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選五金散顆粒制備工藝

摘 要:目的：將五金散原方在湯劑的基礎(chǔ)上改制為顆粒劑， 用正交試驗(yàn)法篩選其最佳提取工藝，建立五金散顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用L9(34)正交設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，用TLC進(jìn)行定性鑒別，用HPLC法進(jìn)行含量測定。結(jié)果：提取最佳工藝為加10倍量水、加熱煎煮3次，每次1．5 h；薄層色譜中可檢出特征斑點(diǎn)；槲皮素和山奈素的加樣回收率分別為98.82％ (RSD=1.07％)和99.51％(RSD=1.10％)(n=5)。結(jié)論：經(jīng)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的五金散顆粒的制備工藝可行；HPLC法易于操作，重復(fù)性好，能夠控制五金散顆粒的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：五金散顆粒；制備工藝；正交試驗(yàn)；HPLC

中圖分類號：R283.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1673-2197（2007）07-049-03

五金散以金錢草、虎杖、大黃、海金沙、雞內(nèi)金等幾味中藥配伍組成中藥方劑，是名老中醫(yī)幾十年臨床總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱利濕、疏肝利膽、活血化瘀排石的作用，用于濕熱型膽囊炎、膽囊結(jié)石及泌尿系統(tǒng)結(jié)石等，臨床運(yùn)用屢見成效。原方為湯劑，服用量大，不易攜帶。為此，對其進(jìn)行劑型改造并確保原有療效，兼顧各種劑型一次服用量的限度，將原方改為顆粒劑。通過正交試驗(yàn)，優(yōu)選出最佳提取工藝，并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)藥材(廣東省中醫(yī)院中藥房)；Agilent I100液相色譜儀包括紫外檢測器(美國惠普)，威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站；CQ-250型超聲波清洗器(330kHz，250W)， 槲皮素和山奈素對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供，批號分別為100081-200307和110861-200308)；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。 

2 方法與結(jié)果

2．1 提取工藝

2.1.1 正交設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及處方中各藥材的性質(zhì)，將藥材與水共煮。以溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為3個(gè)考察因素，因素水平見表1。以浸膏中主要有效成分槲皮素和山奈素的提取率和出膏率為考察指標(biāo)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果 稱取處方規(guī)定量的藥材飲片共9份，采用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，測定出膏率及山奈素轉(zhuǎn)移率，以綜合評分的方式對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表2，方差分析見表3。從表2、表3結(jié)果分析可以看出，9次正交試驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)對浸膏收率及山奈素含量均有顯著影響，各因素的影響程度依次為提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞溶劑用量，綜合分析各個(gè)因素對山奈素轉(zhuǎn)移率和出膏率的影響，最后選定最佳提取條件為10倍量水，煎煮提取3次、每次1.5h。按此優(yōu)化條件做三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。從表4結(jié)果可知，所選工藝條件均優(yōu)于L9(34)正交表中任一工藝條件。

2.2 輔料選用

顆粒劑常用輔料有糖份、糊精、淀粉等。為使產(chǎn)品口感好，含糖量又不高，選用糊精、淀粉(1∶2)加適量甜菊苷作輔料，制成混懸性顆粒劑。

2.3 制備工藝

取處方規(guī)定量的藥材，以水為浸出溶媒，用煎煮法分三次提取，共4.5 h，合并三次煎煮液，濃縮至一定相對密度，加入95%乙醇至含醇量達(dá)60%，攪勻，靜置24小時(shí)，取上清液，回收乙醇至無醇味，得相對密度為1.15～1.20的清膏，將清膏濃縮成浸膏，加糊精、淀粉及適量甜菊苷，制粒，烘干，整粒，分裝，即得成品。

3 定性鑒別

金錢草的薄層鑒別：取本品1g，加甲醇30 ml置水浴上回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5ml使溶解，用醋酸乙酯振搖提取2次。每次l5 ml，棄去醋酸乙酯液，水層再用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次25 ml，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取金錢草對照藥材粗粉4g。同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:0.5:1)為展開劑，展至9cm，取出晾干，再以相同展開劑，同一方向展開至相同距離，取出晾干，噴以三氧化鋁試液，70℃加熱5分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上．顯相同顏色的斑點(diǎn)。

4 含量測定

4.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱(4.6mm ×250mm，5μm)，流動相為甲醇-0.4％磷酸(55：50)，流速1.0ml／min，檢測波長360nm，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：5μL；理論板數(shù)按槲皮素計(jì)算不低于5000。在此條件下，樣品中槲皮素和山奈素色譜峰分別與其它成分分離良好。

4.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的槲皮素和山奈素對照品5.12mg、5.02mg，置10ml量瓶中，加80％甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液(槲皮素0.512mg／m1、山奈素0.502mg／m1)，精密吸取lml，置10ml量瓶中，加80％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(槲皮索51.2μg／ml、山奈素50.2μg／m1)。

4.3 供試品溶液的制備

取五金散顆粒約3g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇溶液50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足流失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25ml，精密加入鹽酸5ml，置90℃水浴巾加熱水解lh，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，用80％甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0．45μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液［1］。

4.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取槲皮素對照品溶液1、2、3、4、5 μL和山奈素對照品溶液1、2、3、4、5 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，槲皮素：Y=1.920×106X +1.713×104，γ=0.9998，線性范圍0.1255～2.259μg；山奈素：Y=2.200×106X+7.130×104，γ=0.9994，線性范圍0.124～2.267μg。

4.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取同一份對照品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得槲皮素色譜峰峰面積平均值為889230，RSD為0.78 ％。山奈素峰面積平均值為459364，RSD為1.95 ％，說明儀器精密度良好。

4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一樣品溶液5μL，分別在制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測定槲皮素和山奈酚色譜峰峰面積，計(jì)算峰面積RSD分別為1.53 ％和1.72 ％，說明樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取批號1同一樣品，精密稱取5份，按樣品測定方法，分別測定槲皮素和山奈素含量。結(jié)果槲皮素和山奈素的平均含量分別為0.2576 mg．mL-1、0.0255 mg．mL-1 ，RSD分別為1.02 ％ 、1.53 ％ 。

4.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批供試品5份，1.0g／份，精密稱定，分別加入槲皮素和山奈索對照品適量，按4.3項(xiàng)下方法制備測定，計(jì)算回收率。結(jié)果槲皮索平均回收率為98.82％，RSD=1.07％ (n=5)，山奈素平均回收率為99.51％ ，RSD=1.10％ (n=5)。

4.9 樣品含量測定

取樣品3批，按樣品溶液的制備方法分別制備樣品溶液，依法測定

5 討論

（1）本文采用水煮醇沉等綜合性制備工藝，能去除藥材中大量水溶性及醇溶性雜質(zhì)，盡可能地提取出了有效成分。改劑后的顆粒劑，有效成分含量較高，穩(wěn)定性良好，服用方便，易于保存。

（2）本實(shí)驗(yàn)樣品溶液的制備是參照《中國藥典》2005年版I部金錢草含量測定項(xiàng)下供試品溶液制備的方法［2］，因本樣品為顆粒劑，因此把回流1 h改為超聲30min，經(jīng)試驗(yàn)證明該法提取效果較好，干擾成分較少。

（3）五金散顆粒劑中金錢草為君藥，其主要化學(xué)成份為黃酮類，采用HPLC法測定五金散顆粒中槲皮素和山奈素的含量，分離度好，回收率高，能有效控制金錢草的含量。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 楊小蘋，于佳華.金錢草品種來源及臨床功用辨析［J］.中國藥師，2000，11(8)：717.

［2］ 國家藥典編委會．中華人民共和國藥典一部［S］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.152.