冰片對ＢＭＳＣｓ透過血腦屏障的影響

摘 要:目的:探討冰片對骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）透過血腦屏障（BBB）的影響。方法:復(fù)制腦缺血再灌注大鼠模型，將大鼠隨機分為BMSCs+冰片組、BMSCs組、冰片組、模型組和正常組5個組；MCAO術(shù)后24小時， 灌服冰片30min后，以3×106 BMSCs經(jīng)右頸總動脈注射入大鼠體內(nèi)；分別于腦缺血再灌注后第1、14、28天檢查各組大鼠的神經(jīng)功能，并于實驗結(jié)束時采血檢測血象、肝腎功能。結(jié)果:BMSCs+冰片組和BMSCs組神經(jīng)功能顯著改善，而前者又優(yōu)于后者；各組大鼠血象、肝腎功能都正常，主要器官組織未見腫塊形成。結(jié)論:冰片能夠促進BMSCs透過BBB，改善神經(jīng)功能；血管內(nèi)移植BMSCs未見明顯的副作用。

關(guān)鍵詞：冰片;骨髓基質(zhì)干細胞;血腦屏障

中圖分類號：R285.6文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）07-046-03

不少研究表明，開竅藥冰片具有促進其它藥物透過血腦屏障（BBB）的作用，但對于開竅藥能否促進相關(guān)細胞透過BBB，目前尚未見報導(dǎo)。近年不少學(xué)者就骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)問題進行了探討，為研究開竅藥對BMSCs透過BBB的影響，我們進行了初步的探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（美國力高），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯），離心機（上海安亭）；754紫外線可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；SDQ-30C雙極射頻電凝器（上海手術(shù)器械廠）。

SD大鼠骨髓基質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基，CYAGEN公司生產(chǎn)，批號：2803200701001；PBS，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：KGB-500-1；胰蛋白酶，Invitrogen Corporation公司生產(chǎn)，批號1356182；青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：U0511641；硫酸鏈霉素，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：050506。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測定試劑盒，批號200509113；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測定試劑盒，批號：20050913；γ-L-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）測定試劑盒，批號：20050914。肌酐測定試劑盒，批號：20051124；尿素氮定試劑盒，批號：20051126；以上試劑由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗動物及分組

SD大鼠，雄性，SPF級，280-320g，40只，隨機分為以下五組：（1）BMSCs+冰片組：急性腦缺血再灌注模型，以BMSCs移植和冰片治療；（2）BMSCs組：急性腦缺血再灌注模型，以BMSCs移植治療；（3）冰片組：急性腦缺血再灌注模型，以冰片治療；（4）模型組：急性腦缺血再灌注模型，不作治療；（5）正常組。另以一只4周齡雄性SD大鼠備取BMSCs。

1.3 急性腦缺血再灌注模型的建立

參照Zea longa等的方法［1］，稍作改良制成MCAO模型，方法如下：大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定。分離左頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈并掛線備用，結(jié)扎頸總動脈，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠心端， 以電凝筆燒斷頸外動脈，于頸外動脈近心段殘端距頸內(nèi)、外動脈分叉處約3mm處作一切口，從切口處將直徑為0.25mm的尼龍線經(jīng)頸外動脈殘段插入頸內(nèi)動脈。尼龍線插入頸內(nèi)動脈后，于入口處輕輕結(jié)扎尼龍線與入口處頸外動脈殘段，然后松開夾閉頸內(nèi)動脈的動脈夾，繼續(xù)插入尼龍線至稍有阻力后略回撤，至線插入深度約20mm，此時大腦中動脈被阻塞導(dǎo)致左腦缺血。此時結(jié)扎入口處，尼龍線外留約1cm，縫合皮膚。2h后輕輕抽出尼龍線，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注。正常組大鼠不作任何手術(shù)處理。

1.4 MCAO模型的評估方法和入選標準

MCAO模型的評估標準采用Zea longa 5級評分法［1］。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀； 1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展右側(cè)前爪；2 分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈； 3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)傾倒； 4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。動物入選的標準:按照Zea Longa 5級評分法，取評分為2、3、4分的動物。

1.5 BMSCs的分離、純化、培養(yǎng)

將4周齡SD大鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5min，取出后將大鼠平放固定在無菌蠟盤上，超凈臺上分離股骨和脛骨，清除骨表面附著的結(jié)締組織，以無菌PBS反復(fù)沖洗，用剪刀去除股骨近端和脛骨遠端，暴露骨髓腔，去除股骨和脛骨另一端的骨骺，5號針頭穿刺骨端，用無菌PBS液沖出骨髓腔中的骨髓至一無菌平皿中，注射器反復(fù)吸吹，盡量避免產(chǎn)生氣泡，使成單細胞懸液。將細胞懸液移入預(yù)置2ml PBS的無菌離心管片，2000r/min離心10min，棄上清，SD大鼠骨髓基質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基重懸細胞，接種于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，72h后換液，去除未貼壁的造血細胞，以后每3d換液一次，每次換液均用無菌PBS洗2次，再換入新培養(yǎng)液，待細胞長至亞單層時，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.6 BMSCs和冰片的濃度

MCAO術(shù)后24小時，以3×106 BMSCs經(jīng)右頸總動脈注射入大鼠體內(nèi)。冰片按250 mg#8226;kg-1的濃度，以1%吐溫配成冰片懸濁液灌胃，于注射BMSCs前30min灌服冰片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.5進行統(tǒng)計，組間兩兩比較均以單因素方差分析進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦缺血再灌注后第1、14、28天Longa評分

2.2 實驗結(jié)束時各組大鼠血象、肝腎功能檢測結(jié)果

3 討論

開竅中藥具有通關(guān)開竅、啟閉回蘇的作用，是治療腦部疾病的常用藥；冰片為開竅藥的代表藥，常作為“引藥”，以增加其它藥物的治療效果，許多中成藥如蘇合香丸、安宮牛黃丸、冰硼散等，都有冰片的配伍應(yīng)用。《本草衍義》指出冰片“獨行則勢弱，佐使則有功”，《本草經(jīng)疏》稱冰片“性善走竅，無往不達”。動物實驗和離體實驗表明：冰片具有促進藥物透過血腦屏障的作用［2-5］。BMSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是近年的研究熱點，有研究表明血管內(nèi)注射的BMSCs能夠透過BBB進入腦內(nèi)并轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細胞［6］，但由于血腦屏障的存在，血管內(nèi)注射的BMSCs透過血腦屏障的數(shù)量很有限［7，8］，難以充分發(fā)揮其治療作用，如何調(diào)控血管內(nèi)注射的BMSCs進入腦實質(zhì)的數(shù)量，是BMSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵。

開竅藥能否促進BMSCs進入腦實質(zhì)內(nèi)，從而提高其療效？本實驗結(jié)果顯示：腦缺血再灌注后28天，即BMSCs移植后27天，BMSCs組和BMSCs+冰片組Longa評分均較模型組有明顯改善，而BMSCs+冰片組療效又顯著優(yōu)于BMSCs組；冰片組和模型組則無顯著性改變；BMSCs移植對血象、肝腎功能沒有明顯的損害；實驗中我們也肉眼觀察了心、肝、脾、肺、腎、腦、皮膚等器官組織，均未見明顯的腫塊形成。實驗結(jié)果提示，血管內(nèi)BMSCs移植有助于受損神經(jīng)功能的恢復(fù)，而移植前灌服冰片可顯著提高其療效；短期內(nèi)未見BMSCs移植明顯的副作用。

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The Influence of Borneol on BMSCs Permeating Through

Blood-brain Barrier

Abstract: Objective: To study the influence of borneol on BMSCs permeating through blood-brain barrier.Methods: The rat model of cerebral ischemia and reperfusion was copied. Then the rats were divided into 5 groups: BMSCs+ borneol group， BMSCs group， borneol group， model group and normal group. 24h after MCAO operation， and 30min after drenching borneol， 3 106 BMSCs were injected through right common carotid artery into each rat of BMSCs+ borneol group and BMSCs group. The nerve function was tested respectively in the 1st， 14th and 28th day after cerebral ischemia and reperfusion. At the experiment endpoint， the level of blood RBC， WBC， PL were examined， and lever and renal function were tested. Results: The nerve function of BMSCs+ borneol group and BMSCs group were improved significantly. While the former was better than the latter. The level of blood RBC， WBC and PL， and the lever and renal function in all groups were normal. No lump was founded in all rats. Conclusions: Borneol can promote BMSCs permeating through BBB to improve nerve function. No visible side-effect was founded in intravascular BMSCs-transplanting rats. 

Key words:Borneol; Bone matrix stem cell; Blood-brain barrier