中藥毒性的代謝組學研究（Ⅰ）：雷公藤甲素的腎臟毒性

摘 要:目的：利用基于核磁共振的代謝組學方法探討雷公藤甲素的腎臟毒性。方法: 以生物核磁共振結合模式識別技術和主成分分析法探討雷公藤甲素口服給藥對大鼠尿液內源性代謝產物的影響。結果：給藥后，尿樣中甘氨酸、醋酸鹽、甜菜堿以及丙酮水平顯著上升，分別顯示首先是腎臟皮層S1受損傷，然后腎乳頭受損傷，最后腎臟皮層S3段受到損傷。主成分分析表明，給藥組與對照組的代謝譜有明顯差異。結論：大鼠尿液的代謝物譜與雷公藤甲素對腎臟造成損害作用密切相關。利用代謝組學方法可以迅速、簡便地分析雷公藤甲素腎臟毒性。

關鍵詞：生物核磁共振;毒性;雷公藤甲素;代謝組學;主成分分析

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2007）07-041-05

近年來，世界生物醫學研究的熱點之一是從全局觀點分析生物體在生理、病理、藥理及毒理狀態下發生的各種動態變化，并形成了以基因組學、蛋白質組學及代謝組學為代表的現代組學分析技術［1-4］。代謝組 (Metabonome) 是反應機體狀況的分子集合，所有對機體健康產生影響的因素均可反映在代謝組中，如基因、環境、營養、藥物(外源物)和時間(年齡)最終通過代謝組對表達施加影響［5］。代謝組學(Metabonomics) 作為一門新興的技術，其研究以生物體液（如血液、尿等）、細胞組織提取物、細胞培養液等為對象，通過定性定量地分析生物系統中內源性代謝物的變化來評價外源性刺激物（如藥物、毒物）對機體帶來的影響，即測定代謝組受外界刺激而發生的變化情況，同時對代謝組數據進行生物信息學分析，從系統生化譜的角度整體地研究生物體對外界刺激的調節及應答機制［6］。因此，通過分析內源性代謝物的變化，就能了解刺激物對機體的影響（無論是直接的還是間接的）。在動物實驗中，采集上述生物樣品，用代謝組學方法分析，就可以明了刺激物是否對機體發生作用和具體作用位置［7］。尤其對于藥物的毒性所在受毒器官、程度以及可恢復性等方面都可得到檢測。而且代謝組學方法可以監測尚未引起組織病理學變化的毒性，其優點十分明顯。

雷公藤甲素 (triptolide) 是從衛矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f） 中分離得到的活性最高的環氧化二萜內酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗腫瘤等生物活性，在臨床上用于治療器官移植的排斥反應、自身免疫性疾病、腎病綜合征、癌癥等，同時還可用于風濕性關節炎、類風濕性關節炎、跌打損傷、腎小球腎炎、紅斑狼瘡、腎病綜合征等疑難病證的治療［8］。文獻報道雷公藤甲素的急性毒性以急性肝壞死為主［9］，亞慢性中毒者的主要死亡原因之一應為腎損害［10］。

本實驗通過高分辨核磁共振技術，結合模式識別 (pattern recognition，PR) 以及主成分分析方法 (principal component analysis，PCA)，研究中藥有效成分雷公藤甲素口服給藥后對大鼠尿液中內源性代謝產物的影響，觀察雷公藤甲素所致大鼠腎損傷及其過程，探討代謝組學對中藥毒性預測、分析方面的應用前景。

1 儀器及試驗材料

儀器: Bruker DPX-300 核磁共振儀。

動物: 雄性SD大鼠 (約150g，購自南京中醫藥大學動物實驗中心)。

實驗試劑: 氘水，2，2，3，3-四氘代丙酸（TSP）購自Sigma公司。雷公藤甲素購自湖北黃石市制藥廠生產黃石制藥廠（每片含雷公藤甲素33 μg)，經提取精制后使用。

2 實驗方法與結果

2.1 動物實驗

SD大鼠10只，隨機分為2組，將雷公藤甲素溶于食用色拉油中，每天早晨8點灌胃給藥 (0.4 mg#8226;kg-1#8226;d-1)，連續給藥七天，對照組給予色拉油。用代謝集尿裝置收集七天的尿液。尿液離心(3000 rpm)，取上清液-20℃保存至測定。

2.2 核磁樣品準備及分析

稱取600 μL尿樣，加入300 μL 1.0M磷酸緩沖液 (pH=7.0) 以消除pH變化導致的各譜圖之間的差異，加入150 μL D2O用作鎖場，D2O內含TSP 作為化學位移內標（δ = 0）。樣品液3000 rpm離心10分鐘，取上層清液，移入NMR樣品管。樣品測試在Bruker DPX-300核磁共振儀上進行，使用修改了的脈沖序列（zgpr）：水峰飽和 (pl9 ＝ 60 dB， d1 = 2s)，脈沖間隔為15.0 s。每個樣品空掃4次，采樣32次。所有實驗都在5 mm的探頭中進行，測試溫度維持在300 K。

2.3 1H-NMR數據處理

使用AMIX (Bruker， version 3.6.8)將大鼠尿液1H-NMR圖譜從δ0.0-10.0 ppm的范圍按0.04ppm分段積分，除去水峰以及尿素峰所在化學位移 (δ= 4.2-6.0 ppm) 將譜圖余下部分導出為積分數據。由于譜圖6.0 ppm以上區域變化較小，而且在0.2-4.2 ppm可見相關信號，0.0-0.2 ppm僅包含TSP峰，因而選取0.2-4.2 ppm的譜圖進行處理分析。

2.4 正常大鼠尿液1H-NMR譜圖代謝物分析

圖1(A)表示正常大鼠尿液的1H-NMR譜圖和尿液中主要代謝物種的化學位移歸屬［1-4］。為了簡化氫譜，同時消除諸如溶劑峰、基線噪音等影響，對所有氫譜利用Amix軟件進行了處理［11］。如圖1(B)所示，將氫譜按照0.04 ppm寬度進行積分，得到柱狀圖，用于進一步統計處理。

2.5 大鼠尿液 1H-NMR 譜圖代謝物分析

圖2顯示了大鼠灌口服給藥7天尿液的典型氫譜。從大鼠0.4 mg#8226;kg-1#8226;d-1劑量染毒后7天尿液的 NMR 譜圖可以清晰的看出，甘氨酸 (glycine)、醋酸鹽 (acetate)、甜菜堿 (betaine) 和丙酮 (acetone) 含量的升高為雷公藤譜圖變化的主要部分。灌胃后1天即發現其甘氨酸、醋酸鹽含量上升。甘氨酸、醋酸鹽含量上升是腎臟皮層S1受損傷的標志之一，且與劑量呈正相關［12］，因此雷公藤甲素對腎的毒性首先是在皮層S1部分。甜菜堿在大約第3天時可觀察到，且其含量在第6天幾乎達到和TMAO同樣多，由于甜菜堿是近曲小管重吸收的腎臟滲透壓平衡化合物，因而其升高顯示藥物對腎乳頭造成了損傷［13］。最后一天樣品中出現了丙酮含量的大幅度增高，表明腎皮層S3段受到損傷［14］。以上數據可以清楚地表明雷公藤甲素對腎臟的毒性、毒性作用部位和過程。

2.6 1H-NMR譜圖的PCA分析

除了上述雷公藤甲素組與對照組的氫譜的明顯差別以外，圖譜的其他部分均非常相似，因此我們采用了主成分分析法 (PCA) 對其進行了進一步的統計分析。結果顯示，KMO和 Bartlett's Test 值達到 0.895，說明 PCA 模型適合于數據的分析。PC1 與 PC2 占據了譜圖91％的信息，因而載荷圖中用 PC1 對 PC2 作圖即可得到譜圖的大部分信息。如圖3(A)所示，第1天的處理組部分位于對照組范圍之內，甚至在第4天毒性增加時，仍然有部分樣品滯留于對照組之中。第5天，所有點均大幅度偏離，主要是N-氧三甲胺以及甜菜堿含量在此時大量增加而導致其圖譜在 PC1 位置上的大幅度改變。第7天，由于丙酮含量的激增，圖譜重新向左下運動。從因子載荷圖3(B)結合氫譜分析可以看出，甘氨酸，醋酸以及乳酸在第一天的變化中占主要部分，二甲基甘氨酸，甜菜堿，N-氧三甲胺的變化成為第5天的主要變化，而丙酮的變化在第7天的變化中占主要地位。以上變化分別代表腎皮層S1，腎乳頭和皮層S3段受到損傷。

3 討論

目前對于代謝組學使用的毒性化合物用量一般較高，大部分用量都達到了1/2 LD50 以上，部分用量達到或超過了LD50量［15， 16］。雷公藤甲素 0.2mg#8226;kg-1，0.4 mg#8226;kg-1 每天一次腹腔給藥10天，動物的血紅蛋白、血小板、谷丙轉氨酶以及尿素氮均無明顯影響，只是大劑量時，白細胞數輕度下降［17］?？紤]代謝組學技術是否能夠作為藥物毒性早期預測和評估技術，參考上述文獻結果以及雷公藤甲素的口服 LD50 為 1.2 mg#8226;kg-1，本試驗選用的劑量為 0.4 mg#8226;kg-1#8226;d-1。

本實驗結果表明雷公藤甲素對大鼠具有明顯的腎臟毒性。其對腎臟的損傷部位及其過程表現為，第一天即可觀察到腎皮層S1受損傷，然后是腎乳頭，最后腎臟皮層S3段受到損傷。醋酸、乳酸、甘氨酸為腎臟皮層S1段毒性標記物，甜菜堿、二甲基甘氨酸為腎乳頭、丙酮為腎臟皮層S3段的毒性標記物。其中以醋酸鹽、甜菜堿和丙酮最為顯著。PCA 分析表明給藥組和對照組能夠被完全區分開來。這些代謝物的變化說明大鼠尿液代謝組學分析能夠較好地反映雷公藤甲素的腎毒性特征，并對毒性作出早期預測。

在本次實驗中，雖然觀測到不同腎臟部位的指標損傷，但是雷公藤甲素的急性毒性以急性肝壞死為主［9］， 作為肝臟受損指標的牛璜酸 (Taurine) 在整個試驗中沒有觀察到任何變化，說明雷公藤甲素在0.4 mg#8226;kg-1#8226;d-1 的劑量下可能對肝臟影響不明顯，這與報道結果一致［17］， 但是也有可能尿液氫譜上的代謝產物無法體現該毒性，進一步對血液中小分子的研究正在進行之中。另外，如何評價受到的損傷是否能夠恢復、如何恢復也在進一步探討之中。

中藥歷史悠久，是我國具有優勢的、特有的寶貴財產，長期以來已被學術界和患者所接受。目前對中藥的研究主要集中在化學成分、藥理、藥效等方面。但是近年來中藥“毒性” 事件的不斷報道，使中醫藥也面臨嚴峻的挑戰。雖然中藥的毒副反應很多是由于過量或錯誤使用所致，然而，中藥成分的復雜性，作用機理的復雜性決定了對其充分研究的困難所在。傳統的中藥安全性評價主要是通過給予一定數量的實驗動物和一定量的待測物，觀察其毒性效應特征。然而，這些評價手段還存在著許多缺點，如動物數量有限難以發現發生率低的毒性反應；實驗周期長及費用昂貴等問題。本實驗結果表明采用代謝組學的方法，不僅具有省時省力，測定方便的優點，并且代謝樣品中的生物指標往往對應特定部位的損傷，因而可以較好的了解毒物作用部位和作用過程。

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Metabonomic Study on the Toxicity of Traditional Chinese

Medicine (Ⅰ): Renal Toxicity of Triptolide

LI Jianxin， HUA Jia， HE Cuicui

Key Lab of Analytical Chemistry for Life Science， School of Chemistry

and Chemical Engineering， Nanjing University， 210093，China

Abstract: Objective: To explore the renal toxicity of triptolide with NMR-based metabonomic method. Methods: To analysis the influences of oral dosing of triptolide on endogenetic metabolites in rat urine using bio-nuclear magnetic resonance (NMR) coupled with pattern recognition technique and principal component analysis (PCA). Results: Dosing of triptolide resulted in increases of the concentrations of acetate， betaine and acetone in urine， which suggested the damages on the renal cortex S1， papilla and cortex S3， respectively. PCA revealed that the matabonomic profile of triptolide-treated group was obviously different from that of control one. Conclusion: The metabonomic profile of urine closely related with the renal toxicity of triptolide. Using metabonomic method the renal toxicity of triptolide could be analyzed simply and rapidly. 

Key words: Bio-NMR; Toxicity; Triptolide; Metabonomics; Principal component analysis