川牛膝的ＨＰＬＣ指紋圖譜研究

摘 要：目的：采用HPLC法構建川牛膝藥材的化學指紋圖譜。方法：采用Waters 2695 高效液相色譜儀，色譜柱為Symmetry^reg;C₁₈(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流動相為甲醇-水二元梯度洗脫；流速為0.9ml/min；柱溫為35℃；檢測波長為266nm。結果：測定基地產及市場上流通的樣品共18批次，標示了11個共有峰，其指紋圖譜相似度均在0.9以上，指紋圖譜整體面貌基本一致。結論：該方法簡便、快速、準確、重現性好，為川牛膝藥材的定性鑒別和藥材內在質量評價提供了依據。

關鍵詞：川牛膝；指紋圖譜；HPLC

中圖分類號：R282.5 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)04-027-03

川牛膝為莧科杯莧屬植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，是著名的川產道地藥材之一，具有逐瘀痛經，通利關節，利尿通淋的功效^[1]。川牛膝始見唐代藺道人的《仙授理傷續斷秘方》。在功效上，目前全國的一些權威著作一致認為“懷牛膝和川牛膝的功效基本相同，但是前者偏于補腎強筋骨，而后者偏于活血化瘀” ^[2]?，F在藥理學研究表明，川牛膝不僅能活血化瘀，還有很好的調節免疫系統功能的作用。

目前國內對川牛膝的研究主要集中在其化學成分及藥理研究方面，缺乏綜合評價藥材品質的方法和標準，且川牛膝在長期的應用和栽培的過程中，種內產生很大的變異，出現倫理較多的類型，同時由于加工、儲存等方法的不同，藥材質量存在較大的差異，造成目前藥材質量不穩定和市場藥材質量無法評價的局面。本研究通過采用HPLC法建立川牛膝藥材指紋圖譜，為控制川牛膝藥材的綜合質量提供參考依據。

1 試驗材料、試藥、試劑與儀器

1.1 試驗材料、試藥、試劑

川牛膝藥材：經成都中醫藥大學峨眉學院王書林教授鑒定為莧科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)的干燥根，符合2005年版《中國藥典》規定，見表1。

對照品：杯莧甾酮(cyasterone)由四川省中醫藥研究所提供。試劑：甲醇(色譜純)，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters2996-2695型高效液相色譜儀；Waters Empower化學工作站；KQ3200型超聲波清洗器(40KHZ，120W)，昆山市超聲儀器公司；BP-211D型電子分析天平(Max：210g，d=0.1mg)，北京賽多利儀器系統有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry^reg;C₁₈(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流動相：甲醇-水二元梯度洗脫，如表2；流速：0.9ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：266nm；進樣量：20μl；運行時間：35min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

取杯莧甾酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg溶液，即得。

2.2.2 樣品溶液的制備

取川牛膝藥材細粉(批號7^#)5g(過四號篩)，精密稱定，置于100ml錐形瓶中，精密量取甲醇50ml，振搖，回流提取1h，放冷，加甲醇補足損失的重量，搖勻，水浴揮干，殘渣加甲醇使溶解，定容至10ml，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得^{[3，4，5，6]}。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20μl，重復進樣5次，≥5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的RSD在1.3263%～2.1634%之間，表明精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取同一批次的川牛膝藥材6份，按上述樣品測定方法分別測定，≥5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的RSD在2.3013%～2.8706%之間，表明方法重現性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24h分別進樣20μl，≥5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的RSD在2.1181%～2.5066%之間，表明樣品在24h內穩定。

2.4 指紋圖譜相似度分析

2.4.1 共有峰的標定

根據18批次供試品測定結果所給出的峰數，對峰值和峰位等相關參數進行分析、比較，川牛膝藥材高效液相色譜可分離出20多個色譜峰，經與杯莧甾酮對照品對照，并比較所有記錄的色譜圖，選取11個共有峰作為指紋圖譜的特征峰，其中9號峰為杯莧甾酮。

圖1 川牛膝HPLC指紋圖譜

2.4.2 共有圖譜模式的建立

根據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》，以參照物峰(S)的相對保留時間和相對峰面積為1，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。杯莧甾酮為川牛膝藥材中的主要有效成分，且其峰面積在圖譜中相對較大，保留時間適中，故選擇杯莧甾酮為參考峰(S)，以其保留時間和峰面積為1，計算各樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.4.3 圖譜相似度分析

根據18批樣品的相對保留時間及指紋圖譜的整體譜峰特點對峰進行匹配，以相對方面積的平均值建立共有模式，見圖2，以相關系數法對樣品的相似度進行評價，各樣品相似度結果見表3，結果表明，大多數樣品之間相似度良好，都達到0.90以上，平均相似度為0.906。

圖2 18批川牛膝樣品指紋圖譜

3 討論

本課題首次將HPLC法運用到川牛膝藥材的鑒定與質量評價中，能更加有效地解決藥材化學成分的多樣性與復雜性的質量評價技術難題。本實驗采用二極管陣列檢測器對指紋圖譜的檢測進行了選擇，結果表明在檢測波長266nm處，色譜圖所包含的信息量更大。從相似度分析結果來看，18批川牛膝藥材相似度均在0.9以上，表現出良好的相似性。在川牛膝藥材指紋圖譜的共有特征峰中，整體分離度較好，能充分反映出川牛膝藥材醇溶性物質的化學成分特征，可用于川牛膝藥材鑒定及內在質量評價。在本實驗建立的川牛膝藥材指紋圖譜分析方法中，杯莧甾酮的保留時間適中，與相鄰色譜峰達基線分離，分離度良好。

本實驗所建立的方法，精密度、穩定性和重復性均符合指紋圖譜研究的技術要求，為進一步制訂川牛膝質量評價標準提供了科學依據。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：人民衛生出版社，2005：26.

[2] 《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編(上冊)[M].北京：人民衛生出版社，1996：217~229.

[3] 陳幸，黎萬壽，朱久武.等.RP-HPLC法測定川牛膝中杯莧甾酮的含量[J].重慶中草藥研究，1999，(40)：69~71.

[4] 馬英，畢開順，王璽等.HPLC法測定川牛膝中杯莧甾酮的含量[J].中草藥，2000，31(6)：427~428.

[5] 黎萬壽，陳幸，李彬.等.正交法優選酒炙川牛膝最佳炮制工藝[J].現代中藥研究與實踐，2005，19(4)：54~56.

[6] 黎萬壽，陳幸，李彬.等.正交法優選鹽炙川牛膝最佳炮制工藝[J].時珍國醫國藥，2005，16(12)：1205~1206.

(責任編輯：萬賢賢)