ＲＰ－ＨＰＬＣ測定腦得生片中４種皂苷的含量

摘 要：目的：建立同時測定腦得生片中三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、Re、Rb₁含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法，Apollo C18-A柱(5 μm，250mm×4.6mm)，以乙腈-水為流動相，梯度洗脫，流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長為203nm。結果：三七中三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁，4種成分在60min內可達到良好分離，在測定范圍內線性良好，回收率在98%～102%之間。結論：所建立的含量測定方法簡便可行，重復性好，可用于腦得生片的質量控制。

關鍵詞：三七；人參皂苷Rg₁；人參皂苷Re；人參皂苷Rb₁；三七皂苷R₁；RP-HPLC

中圖分類號：R927.2 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)05-038-03

腦得生片收載于《中國藥典》2005年版(一部)，是由三七、紅花、葛根、川芎、山楂5味藥材制成的中藥復方制劑，具有活血化淤、疏通經絡、醒腦開竅等功效。臨床用于腦動脈硬化、缺血性腦中風及腦出血后遺癥等。三七為該方主藥，含有多種三七皂苷及人參皂苷成分^[1]，有關采用HPLC法測定三七藥材及制劑中多種皂苷的方法已有報道^[2，3]。本實驗采用反相高效液相色譜法，以人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁及三七皂苷R₁，4種皂苷成分作為該制劑的同步定量測定指標，能更有效地控制制劑的質量。

1 儀器與試藥

shimadzuLC-10Atvp型高效液相色譜儀，shimadzu SPD-10Avp型紫外檢測器，N3000色譜工作站，AY120SHIMADZU分析天平；人參皂苷Rg₁(110703-200322)、人參皂苷Rb₁(110704-200318)、人參皂苷Re(110754-200319)和三七皂苷R₁(110745-200312)對照品(中國藥品生物制品檢定所)，腦得生片樣品(自制)，乙腈為色譜純(CaledonLaboratoriesLTD.)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Apollo5u C18-A(250mm×4.6mm)；流動相：A(乙腈)-B(水)，梯度洗脫，0～15 min(19%A，81%B)，15～40min(19%A～25%A，81%B～75%B)，40～70min (25%A～50%A，75%B～50%B)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長203nm；柱溫30℃；進樣量10μL。HPLC圖見圖1，三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁在上述色譜條件下與其他成分實現了基線分離。

2.2 對照品溶液的制備

分別稱取三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁對照品各5 mg、10mg、5mg、10mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成含三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁、人參皂苷Re分別為0.260mg·mL-1、0.412 mg·mL-1、0.420mg·mL-1、0.204 mg·mL-1的混合對照液。

2.3 三七藥材對照液的制備

取三七粉末(過四號篩)0.6 g，精密稱定，加入甲醇50mL，稱定重量，放置過夜，置80℃水浴上保持微沸2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過取續濾液，即得。

2.4 供試品溶液及陰性對照液的制備

取本品20片，精密稱定，研細，取約1g，精密稱定，加入甲醇15mL，稱定重量，置水浴上回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過取續濾液，即得。同法制得三七的陰性對照液。

2.5 方法學考察

①線性關系考察：分別精密吸取上述混合對照溶液2、4、6、12、16、20(μL)，分別注入高效液相色譜儀中，測定其峰面積，并以對進樣量(X，μg)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標進行線性回歸處理，回歸方程分別為：

三七皂苷R₁：Y=1.6220×105X+2.7527×103(r=0.9997)；人參皂苷Rg₁：Y=1.9604×105X-2.8334×103(r=0.9999)；人參皂苷Re：Y=1.4266×105X+5.3408×103(r=0.9993)；人參皂苷Rb₁：Y=1.5235×105X+1.6954×103(r=0.9999)。

結果表明，三七皂苷R1在0.520～5.20μg范圍內具有良好的線性關系；人參皂苷Rg1在0.824～8.24μg范圍內具有良好的線性關系；人參皂苷Re在0.408～4.08μg范圍內具有良好的線性關系；人參皂苷Rb₁在0.840～8.40μg范圍內具有良好的線性關系。

②精密度試驗：精密吸取上述混合對照溶液與供試樣品液10μL，分別連續進樣6次，在上述色譜條件下測定4種組分的峰面積積分值，結果對照品的三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁的RSD分別為2.51%、1.42%、1.97%、1.38%，供試樣品液的三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁的RSD分別為2.82%、1.03%、1.35%、1.81%。

③重復性試驗：取同一樣品，按供試品溶液制備方法制備6份供試樣品液，進樣測定，記錄峰面積，測定結果得三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁的RSD分別為2.46%、1.53%、1.68%、1.86%。

圖1 HPLC圖

A對照品 B三七藥材 C樣品 D陰性樣品

1-三七皂苷R₁ 2-人參皂苷Rg₁ 3-人參皂苷Re 4-人參皂苷Rb₁

④穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24h進樣測定，結果三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁的峰面積的RSD分別為1.16%、1.04%、1.34%、1.55%，表明待測成分在24h內穩定。

⑤加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的腦得生樣品6份，每份分別精密加入三七皂苷R₁與人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁對照品適量，按照供試品溶液制備方法進行操作并測定，計算回收率，結果見表1~4。

⑥樣品測定：取不同批次腦得生片樣品，按2、4項下操作制備供試品溶液各三份，按上述液相色譜條件進樣進行分析測定，結果見表5。

3 討論

本實驗在色譜條件選擇時，比較了多種流動相的梯度條件，最后確定的流動相梯度條件能使三七藥材和制劑處方中三七的四種成分都達到有效分離。在實驗過程中，發現較難分離的主要是人參皂苷Rg₁與人參皂苷Re，因此在設計梯度條件時應充分考慮對人參皂苷Rg₁與人參皂苷Re的分離效果，同時考慮復方中其他成分的干擾。經實驗證實，該方法穩定、可靠、分離效果良好，可用于該制劑的質量控制。

從所得的色譜圖中發現，保留時間63min處的色譜峰為三七藥材中的一個特征峰，并經初步驗證該峰為人參皂苷Rd，可為三七中五種皂苷成分的測定及指紋圖譜研究提供色譜條件的參考。

參考文獻：

[1] 劉剛，鮑建材，鄭友蘭.三七的化學成分研究進展[J].人參研究，2004，(2)：10~17.

[2] 沈國芳，吳永江，程翼宇.RP-HPLC測定血栓通注射液中4種皂苷的含量[J].中國藥學，2003，38(9)：698~699.

[3] 楊雪梅，劉 旭，劉艷山，等.高效液相色譜法測定三七中三七皂苷R₁及人參皂苷Rg₁，Rb的含量[J].時珍國醫國藥，2005，16(8)：710.

(責任編輯：陳涌濤)