普通小麥－簇毛麥易位系Ｔ４ＶＳ．６ＡＬ的選育

(南京曉莊學院生命科學系，南京211171)

摘要：在小麥背景中離果山羊草3C染色體具有優先傳遞的作用#65377;當離果山羊草3C染色體處于單體狀態時會導致后代不含有殺配子染色體的配子中產生包括缺失和易位等染色體結構變異#65377;簇毛麥4V染色體攜有抗小麥眼斑病和全蝕病基因#65377;為進一步利用簇毛麥4V染色體上的有益基因，利用染色體C－分帶和基因組原位雜交分析，從普通小麥－簇毛麥4V染色體二體異附加系(DA4V)與普通小麥農林26－離果山羊草3C染色體二體異附加系(DA3C)雜種后代中選育出小麥－簇毛麥純合易位系T4VS·6AL#65377;該易位系為殺配子染色體誘發形成的非補償型易位；易位系T4VS·6AL高抗梭條花葉病，是小麥抗病育種的新種質#65377;

關鍵詞：普通小麥；簇毛麥；T4VS·6AL易位；C－分帶；熒光原位雜交

中圖分類號：S512．1；Q813．4文獻標識碼：A文章編號：0439－8114(2008)06－0611－04

Breeding of Triticum aestivum－Haynaldia villosa Translocation Line T4VS·6AL

CHEN Quan－zhan，ZHANG Bian－jiang，CHEN Hua－feng，HUA Chun

(Department of Life Science，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing 211171，China)

Abstract： Chromosome 3C of Aegilops triuncialis were of the ability to be transferred preferentially in the case of its monosomic status in wheat background． Whereas， those gametes without 3C would result in chromosome structural changes including deletion and translocation． Eyespot and take－all resistance gene was mapped on chromosome 4V． The objective of this study was to develop more translocation lines involving chromosome 4V， and provided new germplasm for wheat breeding． Triticum aestivum－Haynaldia villosa 4V disomic addition line was crossed with T． aestivum “Norin 26”－Ae． triuncialis 3C disomic addition line ， and the hybrids F1 were then self pollinated． Both chromosome C－banding and fluorescent in situ hybridization (FISH) were applied to screen chromosome variations of 4V． One heterozygous translocation line involved in 4V and 4A (CQZ98) was identified from F2， and a homozygous translocation line(CQZ98－1) was selected from the offspring of CQZ98 and confirmed by chromosome pairing analysis at meiosis Ⅰof pollen mother cells (PMC)． The results of simple sequence repeat(SSR)analysisindicated that CQZ98－1 did not contain4VL， and designated as T4VS·6AL． This translocation line showed high resistance to wheat spindle streak mosaic virus．

Key words：Triticum aestivum； Haynaldia villosa； T4VS·6AL translocation； C－banding； fluorescent in situ hybridization

簇毛麥(Haynaldia villosa，2n=14，VV)屬于禾本科(Gramineae)，小麥族(Triticeae)小麥亞族(Triticum) 簇毛麥屬(Haynaldia Shar．)，具有抗白粉病#65380;抗銹病#65380;抗梭條花葉病#65380;抗全蝕病#65380;分蘗力強#65380;小穗數多#65380;耐旱以及子粒蛋白質含量高等優良性

狀[1－3]#65377;前人已成功地將簇毛麥6V染色體上的抗白粉病基因(Pm21)通過異附加系#65380;異代換系和易位系等方式導入普通小麥栽培品種[4－6]#65377;簇毛麥4V染色體的長臂上攜有抗小麥眼斑病基因[7，8]，短臂上攜有抗小麥梭條花葉病的基因[9]#65377;Endo等[10，11]發現在小麥與柱穗山羊草或離果山羊草的雜種后代中，柱穗山羊草的2C和離果山羊草的3C染色體具有優先傳遞的功能，并將具有這種功能的染色體稱為殺配子染色體#65377;隨后的研究又發現在中國春背景中的柱穗山羊草2C和農林26背景中的離果山羊草3C染色體既能引起染色體結構變異，同時對它的后代的育性#65380;結實率影響較小#65377;利用這一特點，Endo等[12]成功地創造出一套涉及中國春小麥21對染色體不同部位不同長度片段缺失的缺失系，并誘導出小麥－黑麥[13]#65380;小麥－大麥[14]易位系#65377;袁建華等[15]利用柱穗山羊草2C染色體的殺配子作用，成功地誘導出小麥－大賴草易位系和涉及大賴草染色體的端體#65380;缺失等結構變異#65377;為了進一步定位4V染色體上的有益基因，并利用它為小麥抗病育種服務，南京農業大學細胞遺傳研究所已創造涉及簇毛麥4V染色體的結構變異體[9，16，17]#65377;本文報道利用農林26背景中的離果山羊草3C染色體誘導普通小麥與簇毛麥4V染色體之間的新易位，結合染色體C－分帶和SSR分析，對易位染色體的組成進行了較精確的鑒定#65377;

1材料與方法

1．1材料

普通小麥農林26－離果山羊草3C染色體二體異附加系(DA3C)，普通小麥4A染色體部分缺失系由日本京都大學Endo教授提供#65377;普通小麥－簇毛麥4V染色體二體異附加系(DA4V)，硬粒小麥－簇毛麥雙倍體(AABBVV)等材料由南京農業大學細胞遺傳研究所提供#65377;

1．2方法

1．2．1根尖細胞染色體制片種子在墊有濕濾紙的培養皿中置20℃培養箱中萌發，待根長1～2 cm時剪取根尖，在冰水中預處理22～24 h后，用卡諾氏固定液(乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定，2～7 d后在45%醋酸中壓片，－70℃冷凍揭片#65377;

1．2．2花粉母細胞減數分裂中期Ⅰ染色體制片挑取處于減數分裂中期Ⅰ的花藥，用卡諾氏固定液固定并放置4℃冰箱中備用#65377;制片時取出花藥以1%醋酸洋紅染色壓片，統計染色體配對構型#65377;或在45%醋酸中壓片，－70℃超低溫冰箱中冷凍后揭片，進行染色體C－分帶和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，FISH)#65377;

1．2．3染色體Giemsa C－分帶染色體Giemsa C－分帶參照Gill等[18]的程序#65377;揭去蓋玻片的載玻片，在無水乙醇中脫水6 h， 然后依次在60℃的0．2 mol·L－1鹽酸中處理2．5 min，室溫下在飽和Ba(OH)2溶液中處理7 min，在60℃的2×SSC溶液中復性60 min#65377;最后在磷酸緩沖液稀釋的Giemsa染色液中染色至適度，用蒸餾水沖洗，氣干后觀察#65380;照相#65377;

1．2．4熒光原位雜交熒光原位雜交參照陳佩度等[19]和Jiang等[20]的方法#65377;用fluorescein－12－dUTP標記的簇毛麥基因組DNA作探針，普通小麥基因組DNA作遮蓋，雜交后的載玻片用碘化丙錠(propidium iodide，PI)套染(PI母液濃度100 mg·L－1)，VECTA shield mounting膠封片，在Olympus BX 60型熒光顯微鏡下用450～490 nm激發光波長觀察，簇毛麥染色體呈綠色，小麥染色體呈紅色#65377;用SPOT CCD(SPOT Cooled Color Digital Camera)照相機攝取圖像#65377;

1．2．5DNA提取和SSR標記分析按單株取葉片，以CTAB法[21]提取DNA#65377;微衛星引物根據R?觟der

等[22]發表的微衛星分子標記連鎖圖進行合成，利用跟蹤4VL的SSR標記[23]進行SSR分析#65377;

2結果與分析

2．1易位系C－分帶和FISH分析

配制DA4V與DA3C雜交組合，F1種子經C－分帶鑒定為真雜種#65377;植株生長正常，套袋自交可結實#65377;采用染色體C－分帶帶型分析，從F2中選出變異單株CQZ98，發現其有一條C－分帶帶型不同于小麥的染色體，該染色體長臂有弱的近端帶#65380;中間帶和近著絲粒帶，與6A染色體長臂的C帶帶型相同#65377;該染色體短臂的端部有一條強端帶，在短臂的近著絲粒處有一條強帶，與4V染色體短臂的C帶帶型相同#65377;初步推測該染色體為簇毛麥4V染色體的短臂和普通小麥染色體6A的長臂易位而成的易位染色體(T4VS·6AL)#65377;進一步從CQZ98自交后代中篩選出純合易位系，編號為CQZ98－1(2n=42，圖1)#65377;

以熒光素標記的簇毛麥gDNA為探針進行FISH分析表明，CQZ98－1的易位染色體確實由小麥與簇毛麥染色體易位所致，易位斷點位于著絲粒處，為整臂易位(圖2)#65377;易位系CQZ98－1花粉母細胞減數分裂中期Ⅰ染色體構型分析發現，易位染色體配對成棒狀二價體(圖3)或環狀二價體，這表明易位系CQZ98－1中的易位染色體為純合易位#65377;

2．2易位系的SSR標記分析

利用跟蹤4VL的SSR標記分析發現，Xgdm145在所有涉及4VL的材料中均能擴增出約120bp的簇毛麥特征帶，而在易位系CQZ98－1中不能擴增出該特征帶(圖4)，表明易位系CQZ98－1中不含有4V染色體的長臂#65377;綜合SSR標記分析和原位雜交結果，推斷該易位系CQZ98－1中含有4V染色體的短臂#65377;

3討論

殺配子染色體可有效誘發普通小麥背景中外源染色體的結構變異，包括缺失#65380;端體#65380;等臂染色體和外源染色體與普通小麥染色體之間的易位，而絕大多數易位系均存在遺傳上不平衡，補償性差等缺點[15，16，24]#65377;在本試驗中選育的易位系CQZ98－1為非部分同源群染色體之間的易位而形成，這一新易位類型的創制進一步豐富了涉及簇毛麥4V染色體的易位庫，也拓寬了小麥品種改良的種質資源#65377;

為了鑒定易位系CQZ98－1對小麥梭條花葉病的抗性，從2006年春季起，連續兩年在南京市六合區的病圃進行抗病性鑒定，以鎮麥9523(病級為4級)為感病對照，普通小麥栽培品種儀寧小麥(病級為0級)為抗性對照，發現易位系CQZ98－1高抗小麥梭條花葉病，與Zhang等[9]報道4VS上攜有抗小麥梭條花葉病毒抗性的結果相吻合#65377;利用本試驗鑒定出的易位系CQZ98－1和前人選育涉及簇毛麥4V染色體的材料[9，16，17]，通過雜交選育有望獲得涉及簇毛麥4V染色體的小片段易位#65377;則可對4V染色體上抗眼斑病基因和抗全蝕病基因進一步進行物理定位#65377;

染色體C－分帶可以將普通小麥21對染色體和簇毛麥染色體相區別[18]，而以外源物種基因組DNA作探針的分子原位雜交能夠準確顯示出外源染色體及染色體片段的數目#65380;大小及易位斷點[6]#65377;將染色體C－分帶和熒光原位雜交相結合，能鑒定出涉及易位的普通小麥與簇毛麥染色體#65377;但是，由于受普通小麥和簇毛麥染色體的C帶帶型豐富度的限制，對于不含帶或無特征帶型的染色體片段的鑒定則存在一定的困難#65377;SSR標記是基于簡單重復序列多態性的一種分子標記，是檢測遺傳變異#65380;鑒定異源染色體和標記基因的輔助工具[25]#65377;由于目前開發的跟蹤4V染色體的標記較少，還沒有開發出可跟蹤4VS的SSR標記[23]，因此本研究運用跟蹤4VL的SSR標記Xgdm145－120對易位系CQZ98－1的分析結果，還有待進一步確證#65377;

4結論

從普通小麥－簇毛麥4V染色體二體異附加系(DA4V)與普通小麥農林26－離果山羊草3C染色體二體異附加系(DA3C)雜種后代中選育出1份小麥－簇毛麥純合易位系T4VS·6AL，易位染色體由簇毛麥4V染色體的短臂和小麥6A的長臂組成#65377;易位系T4VS·6AL高抗梭條花葉病，是小麥抗病育種的新種質#65377;

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