慶大霉素的毒副作用及其殘留檢測

(1．新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊830052； 2．河南科技學院動物科學學院，河南 新鄉453003)

摘要：就慶大霉素(GM)的作用機理#65380;體內代謝#65380;毒副作用#65380;在動物體內的殘留及其檢測方法等進行了詳盡闡述#65377;

關鍵詞：慶大霉素(GM)；毒副作用；殘留；檢測

中圖分類號：S859．79+6；S859．84 文獻標識碼：A 文章編號：0439－8114(2008)06－0723－03

Detection Methods of Residue of _gentamicin and Its Toxicity and Side－effect

LI _gui－ping1，ZHANG Hai－tang2，WANG Zi－liang2

(1． College of Animal Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China；

2． College of Animal Science， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China)

Abstract： The function mechanism， internal metabolism， toxicity and side effect，residues in animal body， detection methods of residues of _gentamicin were reviewed in the paper．

Key words： _gentamicin(GM)； toxicity and side effect； residue； detection

慶大霉素(Gentamicin，GM)屬于氨基糖甙類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細菌，由于其抗菌譜廣#65380;療效佳且價格低廉而廣泛應用于獸醫臨床和動物飼料添加劑#65377;但GM的血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應用過程中易產生毒副作用，尤其大劑量不規范使用，易導致動物性食品中GM殘留超標，對人體健康構成危害，造成腎毒性和耳毒性[1]#65377;許多國家在動物生產中嚴禁使用GM或規定有嚴格的最高殘留限量(MRL)，我國農業部235號公告規定，動物性食品中GM的MRL為100 ng·mL^－1#65377;盡管我國對GM殘留給予了高度重視，但目前尚未建立國家檢測標準，GM在動物生產中的濫用現象仍十分嚴重#65377;

1 gM的毒性作用機理

腎毒性和耳毒性是GM的兩個主要毒副作用#65377;目前研究表明，GM在正常生理pH值時，含有帶正電荷的自由氨基基團因與腎小管上皮細胞或毛細胞表面的特異性受體結合后進入細胞內形成囊泡，后者與初級溶酶體結合形成次級溶酶體，由于溶酶體膜的通透性增加，大量的溶酶體酶釋放，作用于線粒體，特異性地抑制線粒體呼吸酶的合成，細胞能量代謝障礙，細胞結構破壞#65377;此外，GM還可直接破壞血管紋，造成內#65380;外淋巴循環障礙，引起藥物積蓄，加重其對毛細胞的毒性作用#65377;在GM的兩個毒性作用中，一般腎功能損害會明顯早于聽功能的損害，而在腎小管上皮細胞出現明顯壞死之前，先有溶酶體和線粒體的損害[2－4]#65377;

2gM的體內代謝及毒副作用

2．1體內代謝

GM內服難以吸收，腸內濃度較高#65377;肌注后吸收快而完全，約0．5～1 h血藥濃度達到峰值#65377;吸收后主要分布于細胞外液，可滲入胸腹腔#65380;心包#65380;膽汁及滑膜液中，亦可進入淋巴結及肌肉組織#65377;有效血藥濃度可維持6～8 h#65377;被吸收的GM約70%～80%以原形藥通過腎小球濾過從尿中排出#65377;新生仔畜排泄顯著減慢，腎功能障礙時半衰期亦明顯延長#65377;

2．2毒副作用

2．2．1耳毒性前庭功能失調，表現為眩暈等，耳蝸神經損害表現為聽力減退，甚至耳聾#65377;與強效利尿藥合用可加強耳毒性#65377;

2．2．2尿毒性主要損害腎近曲小管，可出現蛋白尿#65380;血尿，嚴重可致腎衰竭，腎毒性與藥物在腎中的濃度成正相關#65377;

2．2．3神經肌肉阻滯本類藥物有類似于箭毒的作用，大劑量使用可引起骨骼肌收縮#65380;呼吸困難等#65377;

2．2．4變態反應可引起皮疹#65380;藥熱等，也可引起過敏性休克，但發生率低于青霉素#65377;

3動物性食品中GM殘留的檢測方法

3．1理化分析法

GM在動物性食品中殘留分析方法，主要以免疫學法進行篩選，以氣相色譜法(GC)#65380;高效毛細管電泳法(HPCE)#65380;高效液相色譜法(HPLC)進行定量，以液相色譜/質譜聯用分析法(LC/MS)進行確證#65377;

3．1．1 _gCMayhew和Gorbach等[5]于1978年建立了GC法，用電子捕獲檢測器測定血清中的GM，將血清樣品凈化提取后，用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分兩步進行衍生化處理，之后上機檢測，由于這種方法較為煩瑣費時，現已很少使用#65377;

3．1．2HPCEHPCE法是由Jorgenson[6]于1981年提出的，可分為毛細管區帶電泳(CZE)#65380;毛細管膠束電動色譜(MEKC)#65380;毛細管凝膠電泳(CGE)#65380;毛細管等電聚焦(CIEF)#65380;毛細管等速電泳(CITP)和毛細管電色譜(CEC)等6種模式#65377;盡管毛細管電泳的模式不同，其作用原理和特點各不相同，但其有著共同的基本原理，以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間的遷移速度的差異而實現分離的一類液相分離技術，不同組分的遷移速度是指電滲和淌度兩個速度的矢量和#65377;由于各組分遷移速度不同，因而經過一定時間后各組分按其速度的大小順序，依次到達檢測器被檢出，得到按時間分布的電泳譜圖，根據譜峰的遷移時間和峰面積或峰高即可進行定性和定量分析#65377;Kaale等[7]研究表明，用鄰苯二甲醛和巰基乙酸衍生化，檢測器為UV，檢測波長為330 nm，電解質包括30 mmol·L^－1硼砂，7．5 mmol·L^－1 β－環糊精和12．5%(v/v)甲醇(pH=10)，此方法在美國藥典和歐洲藥典上已被規定#65377;

3．1．3HPLC① 電化學HPLC：由于GM中有電活性分子，Europe Pharma－copoeia 4．5版采用脈沖電化學檢測器(PED)，使GM在外加電壓的作用下，在檢測池內產生電解反應，即在工作電極表面進行氧化還原反應，產生不同的電流，從而檢測器能檢測GM的各組分#65377;齊雪琴等[8]采用電化學檢測器液相色譜測定GM組分及雜質，無需采用衍生化反應，可以直接進樣，且檢測靈敏度高#65380;分離效果好#65377;該方法在所測定的范圍內具有良好的線性(r>0．99)，重復測定及耐用性的相對標準偏差組分均小于2%，雜質均小于10%，C2a組分的最小檢測濃度為2 μg·mL^－1#65377;結果表明該方法測定GM組分及雜質是一種簡便#65380;準確的分析方法#65377;②反相HPLC：由于GM化合物的主要特征是缺少紫外熒光發色基團和親水性強，因此用反相HPLC－UVD/FLD分析時，為改善其可檢性和分離效果，常在柱前或柱后對GM進行衍生化，使極性降低，以改善其在色譜柱的分配特性#65377;最常用的衍生化試劑是鄰苯二醛和1－氟－2，4二硝基苯(FDNB)#65377;Abdulsalam和Brian等[9]使用C18和C8分離柱，流動相一般由醋酸緩沖液和甲醇和乙氰組成#65377;GM具有極性和離子特征，它們通常在反相色譜柱上不易分離，但通過在流動相中加入醋酸緩沖液，可以改善它們在C18柱上的分配性能，醋酸離子起平衡離子的作用，與GM形成離子對#65377;

3．1．4LC/MSCherlet等[10]于2000年將內標物GM和托普霉素的色譜分離，用10 mM戊氟代丙酸和已睛作為流動相，用LS/MS方法測定出了GM的4種主要組成成分C1a#65380;C2#65380;C2a和C1，LC/MS方法靈敏準確，其檢測限可達到0．5 ng·mL^－1#65377;Horie[11]等于2001年用C18柱分離樣品，以0．18 mL·min^－1流速5 mmol·L^－1七氟丁酸酐－已睛(88∶12)作為流動相，其最后在豬和牛肌肉中的GM回收率達73．2%～82．6%，檢測限達到2 ng·mL^－1#65377;LC/MS作為一種確證方法，不需要衍生化處理，操作簡便，靈敏度高，檢測限低，有很強的檢測和確證能力，目前作為理想的殘留確證方法已進入實際應用階段#65377;

3．2免疫分析方法

免疫分析方法(IA)是以抗原抗體特異性#65380;敏感性#65380;可逆性反應為基本原理，以不同的抗原抗體反應載體為技術建立起來的分析方法，包括放射免疫測定法(RIA)#65380;酶聯免疫吸附測定法(ELISA)#65380;底物標記熒光免疫測定法(SLFIA)#65380;固相免疫傳感器法(SIS)和膠體金免疫層析法(GICA)#65377;

3．2．1RIA其基本原理是樣品中待測的GM(Ag)和放射性標記已知量的GM(Ag*)與相應已知量的GM Ab競爭反應，最終形成的Ag*Ab與Ag的含量呈負相關#65377;當Ag濃度高時，大部分GM Ab與之結合成抗原抗體復合物AgAb，而Ag*大多被分離，檢測到的放射性強度較低；反之，當Ag濃度低時，大部分GM Ab與Ag*結合成抗原抗體復合物Ag*Ab，Ag*不被分離，檢測到的放射性強度也較高#65377;通過GM標準品與放射性強度關系繪制標準曲線，可建立GM的RIA檢測方法#65377;常用的標記物是同位素3H#65380;14C#65380;125I等#65377;Broughton等[12]早在1976年用125I標記的酰化劑3－(4－羥苯基)丙酸N－羥基琥珀酰亞胺酯使GM產生了碘化的偶合，碘化GM的放射免疫測定法檢出靈敏度是80 pg·mL^－1#65377;RIA的優點在于靈敏#65380;特異#65380;簡便，但標記物易衰變，影響了其準確性#65377;

3．2．2ELISA其基本原理是抗原抗體的特異性#65380;可逆性反應，ELISA采用的是非均相競爭模式，又包括直接競爭模式和間接競爭模式#65377;直接競爭模式可表示為：Ag+Ag*+mAb=AgmAb+Ag*mAb+Ag+Ag*+mAb，間接競爭模式可表示為：Ag+Ag**+mAb=AgmAb+Ag*mAb+Ag+Ag*+mAb#65377;其中Ag為待測游離GM，Ag*為酶標記GM，Ag**為包被抗原，mAb為GM單克隆抗體，AgmAb為游離GM與GM單克隆抗體復合物，Ag*mAb為酶標記GM與GM單克隆抗體復合物，Ag**mAb為包被抗原與GM單克隆抗體復合物#65377;Ag與Ag*共同競爭mAb上的有限位點，反應達到平衡后洗脫多余的Ag與Ag*，用HRP及其底物顯色系統顯示AgmAb#65380;Ag*mAb的結合情況，進而定量檢測GM在樣本中的含量#65377;Standefer 等[13]最先通過與放射免疫方法的比較，建立了用ELISA對GM的測定，但由于對ELISA法反應條件把握不準和對GM半抗原設計不夠合理，其最終檢測限為0．4 mg·L^－1#65377;但ELISA用于小分子藥物殘留檢測目前已成為成熟技術，不僅避免了RIA存在的穩定性問題，而且更加簡便#65380;靈敏，許多ELISA試劑盒的檢測限達到pg級，同時可檢測多數樣品，是十分理想的快速篩選手段，缺點在于出現假陽性的概率較大，易引起誤判#65377;

3．2．3SLFIA其基本原理是用4－甲基傘形酮－β－D－半乳糖苷(4－MUG)標記藥物(Ag^MUG)與待測藥物(Ag)競爭結合限量特異性抗體(Ab)，待測抗原(Ag)越多，形成Ag^MUG－Ab越少，剩余Ag^MUG越多#65377;由于大分子的空間位阻效應，酶對Ag^MUG－Ab復合物種的底物失去催化作用，加入β半乳糖苷酶(β－Gal)后，酶催化分解Ag^MUG上的4－^MUG產生4－MU(4－甲基傘形酮)越多，激發后發出的熒光越強，即待測抗原濃度與熒光強度成正比#65377;即：Ag^MUG(定量)+Ag(待測)+Ab(限量)=Ag^MUG－Ab+Ag－Ab+Ag^MUG#65377;Hospes等[14]于1982年用SLFIA檢測血漿中的GM含量，得到了較好的檢測結果#65377;Place等[15]研究表明，當底物熒光標記GM的單克隆抗體時，其靈敏度為2 μg·mL^－1，且具有較高的重復性#65377;此法由于操作煩瑣，且檢測限較高，目前在殘留檢測中已很少使用#65377;

3．2．4SIS其基本原理是將免疫測定法與傳感技術相結合而構建的一類新型生物傳感器，利用抗原抗體特異性吸附反應的性質，將抗原或抗體固定在傳感器基體上，通過傳感技術使抗原抗體反應時產生的物理#65380;化學#65380;電學或光學上的變化轉變成可檢測的信號來測定待測分子的濃度，可分為非標記型和標記型兩類免疫傳感器，其關鍵步驟是抗原#65380;抗體的制備和抗原或抗體的固定#65377;Valerie等[16]用ELISA和生物傳感器方法檢測了牛奶中的GM殘留量，與ELISA試劑盒比較，樣品預處理簡單，不僅檢測結果準確，還可消除假陽性結果，防止漏檢#65377;因此，免疫傳感器是一種穩定#65380;靈敏#65380;準確#65380;重復性好的檢測篩選方法，但目前實際應用較少#65377;

3．2．5 _gICA其基本原理是HAuCl4在還原劑作用下聚合成金顆粒，由于金顆粒之間的靜電作用和布朗運動，使其保持水溶膠狀態，膠體金富含電子和強大的給電子能力，在膠體溶液pH8．2條件下，以非共價鍵與GM單克隆抗體結合形成金標抗體(Ab－Au)，將金標抗體干燥在玻璃纖維棉上，一端與固定有GM完全抗原(檢測線)和二抗兔抗鼠IgG(質控線)的硝酸纖維素膜(NC膜)相連，另一端與樣品墊相連，加入待測樣品后，金標抗體重新水化并與樣品相互反應，在毛細管的擴散作用下沿著吸水紙方向移動，至檢測線時，若樣品中不含GM，金標抗體就會與完全抗原反應而被部分截獲，金顆粒富集而出現明顯直觀的紅色條帶，至質控線時，金標抗體與兔抗鼠IgG反應同樣會出現紅色條帶；若樣品中含有GM，GM已與金標抗體反應而占據了金標抗體上的有限位點，不再與完全抗原反應而越過檢測線，不出現紅色條帶，僅在質控線與兔抗鼠IgG反應，金顆粒富集而出現紅色條帶#65377;GICA法特異#65380;敏感#65380;快速#65380;簡便#65380;直觀，但其缺陷是不易定量#65377;

GM免疫學檢測方法具有靈敏#65380;快速#65380;特異#65380;簡便等優點，近年來倍受國內外學者的關注，是今后GM殘留快速檢測的發展方向，國外如德國Dade Behring公司等已開發出用于GM殘留檢測的相關產品，我國有關研究起步較晚，目前國內尚屬空白#65377;

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