大孔樹脂Ｄ－１０１、Ｘ－５、ＡＢ－８對(duì)烏頭總堿的純化工藝

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng)621000)

摘要：選擇最佳的分離純化附子總生物堿工藝，以總生物堿的提取率為指標(biāo)，比較確定高效的粗提條件和優(yōu)化的樹脂純化工藝#65377;確定了最佳粗提條件和最佳吸附樹脂X－5#65380;AB－8#65380;D^－101的洗脫#65380;吸附條件#65377;X－5#65380;AB－8#65380;D^－101可用于工業(yè)化烏頭總堿的提取#65377;

關(guān)鍵詞：D^－101#65380;X－5#65380;AB－8樹脂；烏頭總堿；純化

中圖分類號(hào)：S567．23+9；R284．3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439－8114(2008)06－0711－04

Extraction and Purification of Total Alkaloids from Aconitum carmichaeli by D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 Macroreticular Resin

WAN Li－xiang，YANG Xiao－sheng，HOU Da－bin

(College of Life Science and engineering South－western University of Science and Technology，Mianyang 621000，Sichan，China)

Abstract：This paper studied the optimum methods of extracting and refining total alkaloidals from Acontum carmichaeli． Taking extraction percentage of total alkaloidals as index， the optimum primary extracting and purity of macroreticular resin methods was selected． The optimum primary extracting， and optimum elution and absorption of D^－101#65380;X－5#65380;AB－8macroreticular resin were determined．

Key words： D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 macroreticular resin；total alkaloidals；purification

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx．)的側(cè)根[1]，為常用中藥，有毒，具有祛風(fēng)除濕#65380;溫經(jīng)止痛功效，臨床上主要用于治療風(fēng)濕#65380;類風(fēng)濕#65380;關(guān)節(jié)炎等癥#65377;附子發(fā)揮藥效的主要成分為其所含的生物堿類物質(zhì)#65377;烏頭總堿具有明顯的鎮(zhèn)痛#65380;抗炎#65380;免疫#65380;抗癲癇及擴(kuò)張血管等作用[2]#65377;新烏頭堿是附子中含量最高的生物堿，也是目前附子中研究較多的二萜生物堿，本試驗(yàn)以附子中烏頭總堿含量為指標(biāo)，考察附子提取液在多種樹脂中的吸附曲線及最佳洗脫條件，以優(yōu)選出樹脂分離附子提取液中烏頭總堿的工藝條件，并得到純化的烏頭堿，為新藥研制奠定基礎(chǔ)#65377;

1材料與方法

1．1材料

附子50KG(采自四川綿陽(yáng)江油地區(qū))#65380;乙腈#65380;氯仿#65380;石油醚#65380;鹽酸#65380;NaOH#65380;乙酸乙酯等試劑均為分析純#65380;D^－101#65380;X－5#65380;AB－8#65380;NKA－9#65380;XAD－7#65380;D－001#65380;007×7(732)型樹脂(天源離子交換樹脂廠)#65380;烏頭堿#65380;新烏頭堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)#65377;高效液相色譜(AKZO NOBEL)#65380;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，恒溫水浴鍋(亞榮儀器廠)#65380;紫外分光光度計(jì)(上海光譜公司)#65380;電子天平#65377;

1．2方法

1．2．1粗提取50 kg的附子進(jìn)行粉碎，并放置于真空干燥箱中，450C條件下12 h，取出待用#65377;用3倍量的95%乙醇溶液進(jìn)行浸泡3次，減壓濃縮成浸膏，待用#65377;

1．2．2樹脂純化

1)樹脂預(yù)處理用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液浸泡24 h使其樹脂能充分溶脹，濕法裝柱，用乙醇以2BV·h^－1的流速通過(guò)樹脂層，洗至流出液與水無(wú)乳白色混濁停止#65377;然后用水以同樣的流速洗凈乙醇#65377;再用5倍樹脂體積的5%HCl以4~6BV·h^－1的流速通過(guò)樹脂柱#65377;然后用水以同樣流速洗至流出液呈中性#65377;用5倍體積的5%的NaOH以4~6BV·h^－1的流速通過(guò)樹脂柱，然后用水以同樣流速洗至流出液呈中性，備用[3]#65377;

2)樹脂篩選對(duì)D^－101#65380;X－5#65380;AB－8#65380;NKA－9#65380;XAD－7#65380;007×7(732)#65380;D－001型樹脂進(jìn)行篩選，確定D^－101#65380;X－5#65380;AB－8大孔吸附樹脂為分離烏頭總堿的最佳材料#65377;

3)樹脂靜態(tài)吸附檢測(cè)通過(guò)不同的溫度#65380;溶液濃度#65380;pH對(duì)其吸附洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化#65377;

4)樹脂動(dòng)態(tài)吸附檢測(cè)對(duì)D^－101#65380;X－5#65380;AB－8進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附的測(cè)定，并確定不同濃度的乙醇溶液的洗脫效果#65377;

1．2．3含量測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[4]川烏附子含量測(cè)定的方法#65377;使用濃度0．O1mol·L^－1的硫酸滴定液，其每1 mL相當(dāng)于12．9 mg的烏頭堿(C34H47NO11)#65377;按下式計(jì)算總烏頭堿的提取率#65377;提取率%=(m1/m2)×100%，式中，m1為提取液中總烏頭堿的質(zhì)量，m2為提取用附子藥材中總烏頭堿的質(zhì)量#65377;同時(shí)，參照文獻(xiàn)[4]，精密稱取附子提取液分別在0#65380;2#65380;4#65380;8#65380;10#65380;12 h測(cè)定溶液成分，測(cè)得12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好#65377;

1．2．4色譜條件色譜柱為Kromasil C18柱[4．6 mm×250 mm(Scienhome)]，檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm，流速：0．8 mL·min^－1，柱溫：300℃，流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)為0．26%的三乙胺溶液(A相)及甲醇(B相)，按表1進(jìn)行梯度洗脫[5，6]#65377;

2結(jié)果與分析

2．1生物總堿的粗提

2．1．1浸泡溶劑的選擇對(duì)于總生物堿的提取分別采用了pH值2～3酸水#65380;75%#65380;85%#65380;95%乙醇溶劑#65380;親脂性有機(jī)溶劑提取法，比較總生物堿含量#65377;分別加4倍量溶劑浸泡1 d后減壓濃縮，調(diào)pH值3．0～4．0靜置12 h，濃縮[7]#65377;測(cè)定總生物堿的含量依次為40．1%，75．5%，94．3%，98．1%，85．1%#65377;由此可確定95%乙醇的提取率最高#65377;

2．1．2溶劑用量的選擇取附子粉適量，分別用1#65380;2#65380;3#65380;4#65380;5#65380;6倍量體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液作溶劑，測(cè)定其含量變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶劑量達(dá)到3倍以后，生物堿含量的提高就變慢了，出于成本考慮，本試驗(yàn)里使用3倍溶劑量進(jìn)行提取#65377;

2．1．3提取時(shí)間的選擇工業(yè)化提取時(shí)由于量較大，不方便使用加熱等手段而需要在常溫下浸泡提取#65377;設(shè)定提取時(shí)間分別為1#65380;2#65380;3#65380;4#65380;5#65380;6#65380;7#65380;8#65380;9#65380;10 d，測(cè)定其含量變化，當(dāng)從第5天開始，生物堿含量的變化就不明顯，因此，選擇5 d為最佳浸泡時(shí)間，對(duì)于浸泡完的殘?jiān)M(jìn)行再次浸泡，測(cè)定含量變化，發(fā)現(xiàn)在第3天后含量變化不明顯，因此，選擇3 d為最佳浸泡時(shí)間，對(duì)于剩下的殘?jiān)俅芜M(jìn)行浸泡，并且測(cè)定含量，發(fā)現(xiàn)第1天后含量變化不明顯，比較第1次第6天增加量#65380;第2次第4天增加量#65380;第3次第1天增加量，第3次第2天增加量，發(fā)現(xiàn)其含量為第3次第1天最高，而第3次第2天增加量非常低，因此，3次浸泡有必要并且為最佳浸泡時(shí)間#65377;

2．2樹脂純化工藝優(yōu)化

2．2．1樹脂的篩選根據(jù)文獻(xiàn)[8]，非極性和弱極性的樹脂與極性樹脂對(duì)二萜生物堿有不同的吸附效果，因此選擇常用的7種樹脂D^－101#65380;X－5#65380;AB－8#65380;NKA－9#65380;XAD－7#65380;D－001#65380;007×7(732)進(jìn)行篩選#65377;取附子提取液適量，用氨水調(diào)pH值至5后備用#65377;將經(jīng)過(guò)預(yù)處理過(guò)得7種樹脂D^－101，X－5，AB－8，NKA－9，XAD－7，D－001，007×7(732)加入過(guò)量溶液，室溫條件下在搖床上振搖24 h，使之充分吸附，測(cè)定吸附后溶液總生物堿的含量#65377;取靜態(tài)吸附飽和的樹脂，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，在室溫條件下置搖床上振搖24 h，測(cè)定總的解吸附后生物堿的含量#65377;根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，計(jì)算各樹脂的靜態(tài)吸附率與解吸附率，吸附率=(吸附前溶液濃度－吸附后溶液濃度)/吸附前溶液濃度×100%，結(jié)果見(jiàn)表2#65377;由表2可見(jiàn)，可以選擇的樹脂有D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 3種型號(hào)#65377;

2．2．2D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 3種樹脂對(duì)附子總生物堿的靜態(tài)吸附溫度#65380;溶液的濃度#65380;pH是影響樹脂吸附效果的重要因素#65377;以靜態(tài)吸附為條件，正交試驗(yàn)研究溫度#65380;溶液濃度#65380;pH因素影響，分別設(shè)置3個(gè)水平的正交試驗(yàn)見(jiàn)表3#65377;

取一定量處理好的D^－101樹脂，加入一定質(zhì)量濃度和pH值的溶液，在設(shè)定溫度條件下在搖床上振搖24 h，使之充分吸附，取靜態(tài)吸附飽和的樹脂，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，在室溫條件下在搖床上振搖24 h，過(guò)濾后測(cè)定總生物堿的含量#65377;以解吸附的總生物堿量為指標(biāo)制定正交試驗(yàn)，結(jié)果及方差分析見(jiàn)表4#65377;由上面兩表結(jié)果可見(jiàn)，因素A顯著，即pH的影響最大，其次是溫度的影響，樣品濃度的影響不顯著，然而溶液濃度過(guò)高在上樣時(shí)容易對(duì)流速造成影響，質(zhì)量濃度過(guò)低，溶液體積大，不利于吸附#65377;所以優(yōu)化上樣條件是A1B1C2，即將6 _g·L^－1溶液調(diào)pH值為4．5#65380;溫度為18℃上樣#65377;

對(duì)X－5#65380;AB－8型號(hào)的樹脂靜態(tài)吸附結(jié)果顯示其最佳的吸附條件同D^－101，6 _g·L^－1溶液#65380;pH值4．5#65380;溫度18℃為最佳的上樣條件#65377;

2．2．3D^－101#65380;X－5#65380;AB－8樹脂對(duì)總生物堿的動(dòng)態(tài)吸附將溶液(總生物堿質(zhì)量濃度為0．6 _g·L^－1)，調(diào)pH值至4．5，緩慢加入裝有D^－101樹脂柱中，控制流速為1．0 mL·m^－1，每10 mL為1部分，滴定法測(cè)定總生物堿#65377;吸附曲線見(jiàn)圖1可見(jiàn)，從第8部份開始出現(xiàn)未吸附的生物堿，隨著流份數(shù)的增加至27份以后，D^－101樹脂對(duì)總生物堿的動(dòng)態(tài)吸附趨于飽和吸附量可達(dá)301．5 mg#65377;由此可知上樣量為每1 mL樹脂載藥不超過(guò)15．03 mg#65377;同樣方法用于X－5#65380;AB－8#65380;X－5樹脂對(duì)總生物堿的動(dòng)態(tài)吸附趨于飽和吸附量可達(dá)338．7 mg，每1 mL樹脂載藥不超過(guò)16．73 mg#65377;AB－8樹脂對(duì)總生物堿的動(dòng)態(tài)吸附趨于飽和吸附量可達(dá)341．4 mg，每1 mL樹脂載藥不超過(guò)16．93 mg#65377;

2．2．4洗脫液的選擇以乙醇為洗脫液，以動(dòng)態(tài)吸附圖為標(biāo)準(zhǔn)，使D^－101樹脂柱處于飽和吸附狀態(tài)，分別用蒸餾水#65380;10%#65380;20%#65380;40%#65380;60%#65380;80%#65380;95%的乙醇溶液作為洗脫液，每一部分洗脫5倍柱體積，洗脫液流速為1 mL·min^－1#65377;不同濃度洗脫物質(zhì)如圖2#65377;由圖2可見(jiàn)，隨著乙醇濃度的提高，洗脫出來(lái)物質(zhì)的量也越大，同樣對(duì)于X－5#65380;AB－8樹脂也隨著乙醇濃度的提高，洗脫出來(lái)物質(zhì)的量逐漸增大，另再以洗脫總生物堿的固體含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3#65377;由圖3可見(jiàn)，10%乙醇其洗脫物中總生物堿含量最高#65377;綜合分析，如果是為了得到純度最高的生物堿，可選用10%乙醇濃度，如果是為了得到最大量的生物堿，可選用95%乙醇#65377;對(duì)于X－5#65380;AB－8樹脂均在10%乙醇含量時(shí)其洗脫物中含有總生物堿含量最高，在95%乙醇濃度下洗脫物總生物堿總量最高#65377;

2．2．5D^－101樹脂再生周期考察將裝有D^－101樹脂的層析柱上反復(fù)進(jìn)行吸附#65380;洗脫，測(cè)定樹脂對(duì)新烏頭堿重復(fù)吸附能力如圖4#65377;由圖4可見(jiàn)，當(dāng)過(guò)了第5次吸附后，其吸附效果的降低開始加強(qiáng)，因此，未達(dá)到更好的效果，此類型樹脂最好使用不超過(guò)5次#65377;X－5#65380;AB－8樹脂最高使用次數(shù)不超過(guò)6次#65377;

3討論

確定附子總烏頭總堿的最佳提取條件為：加3倍藥材量的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液作為溶劑，浸提3次，第1次5 d，第2次3 d，第3次1 d#65377;提取液調(diào)pH值3～4靜置12 h，回收乙醇并濃縮至一定體積，確定D^－101的最佳吸附洗脫條件為87．5%和95．3%，X－5最佳吸附洗脫條件為92．7%和88．7%，AB－8最佳吸附洗脫條件為93．6%和89．9%#65377;D^－101#65380;X－5#65380;AB－8大孔吸附樹脂純化時(shí)，上樣時(shí)藥液濃度為6 _g·L^－1，pH值為4．5，室溫為18℃以蒸餾水除雜，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液1 mL·min^－1流速洗脫，濃縮洗脫液，完全蒸干，測(cè)定其中附子總生物堿的平均含量分別為D^－101高于48%#65380;X－5高于50%#65380;AB－8高于51%#65377;確定了10%乙醇溶液和95%乙醇溶液在洗脫烏頭總堿時(shí)的特點(diǎn)，對(duì)于正交分析中影響不明顯的濃度，確定了它在實(shí)際洗脫中的特點(diǎn)，并確定了其最佳的濃度#65377;

參考文獻(xiàn)：

[1]符華林．我國(guó)烏頭屬藥用植物的研究概況[J]．中藥材2004，27：149^－152．

[2]張衛(wèi)東，韓公羽，梁華清，等．國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥附子成分與活性的研究[J]．踐雜志，1996，14(2)：91－94．

[3]畢紅霞，李建偉，陳瑋，等．28吸附樹脂對(duì)歐李紅色素的吸附和精制[J]．鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25(2)：41．

[4]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005．

[5]柳文媛，流靜涵，張正行，等．HPLC法測(cè)定兩種烏頭藥材中生物堿的含量[J]．西北藥學(xué)雜志，1998，13：8－9．

[6]陳幸，夏文娟，方娜娜．對(duì)中國(guó)藥典附子中烏頭堿限量檢查的商榷[J]．藥物分析雜志，1995(4)：6－8．

[7]梁春妹，嚴(yán)汝慶．附子生物堿提取影響因素的實(shí)驗(yàn)探討[J]．中國(guó)中藥雜志，2004，29：222－224．

黃建明，郭濟(jì)賢，陳萬(wàn)生．大孔樹脂對(duì)草烏生物堿的吸附性能及純化工藝[J]．復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，30(3)：267－269．