３種脫除南瓜水溶性多糖蛋白方法的比較

(1．華中農業大學園藝林學學院/國家蔬菜改良中心華中分中心，武漢430070；2．武漢理工大學化學工程學院，武漢430070)

摘要：探討了三氯乙酸法#65380;重金屬離子沉淀法和Sevag法3種方法對南瓜多糖提取物進行脫除蛋白處理的效果#65377;結果表明，綜合考慮多糖損失率#65380;脫除蛋白率和活性等因素，Sevag法優于三氯乙酸法和重金屬離子沉淀法，是適用于南瓜水溶性多糖脫除蛋白的有效方法#65377;

關鍵詞：南瓜；多糖；游離蛋白

中圖分類號：Q539，Q591．2文獻標識碼：B文章編號：0439－8114(2008)06－0717－03

Comparison of Three Methods for Removal of Protein from Pumpkin Polysaccharide

LI Jun－li1，2，WANG Yun－qiang1，XIANG Chang－ping1

(1．College of Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University/ Huazhong Branch of National Vegetable Improvement Center， Wuhan 430070，China；2． College of Chemical Engineering，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China)

Abstract： In this study，three methods (trichloroacetic acid method， Cu2+ method and Sevag method) were used to remove protein from pumpkin polysaccharide． The results showed that Sevag method was better than other two methods to remove protein from pumpkin polysaccharide， which was more effective in the removal percentage of protein， the loss of polysaccharide and physiological activity of polysaccharide．

Key words： pumpkin； polysaccharide； removal of protein

南瓜屬(Cucurbita)是一個大族群，它起源于中#65380;南美洲[1]，在美國西南部#65380;墨西哥及南美洲北部已被廣泛栽培，種質資源十分豐富多樣#65377;南瓜對環境適應性很強，易栽培，產量高#65377;近年來，人們發現南瓜不僅營養豐富，而且長期食用具有保健和防病治病的功能#65377;現代研究表明，南瓜含有降脂#65380;降糖#65380;防癌等多種功能性因子[2，3]，其中南瓜多糖直接參與降血糖#65380;降血脂等有關活動，因而受到醫藥界的高度重視，具有十分廣闊的開發利用前景#65377;

本實驗室已有研究表明，南瓜中多糖含量很高，因此對南瓜中的多糖物質進行系統研究并闡明其生物活性，這對于開發高技術含量的南瓜多糖保健食品具有重要意義#65377;其中南瓜多糖的分離純化是首要和關鍵步驟#65377;純化程度的高低直接影響到后續的結構分析#65380;藥理活性#65380;構效關系研究的準確性#65377;而去除粗多糖中游離蛋白是獲得純品多糖非常關鍵的一步#65377;因此，為提高其活性，同時為進一步研究多糖提供較純的物質原料，本試驗對南瓜粗多糖中蛋白質的去除方法進行了研究#65377;

1材料與方法

1．1試驗材料與儀器

試驗材料為南瓜，來源于本試驗基地種植的老熟瓜#65377;試驗儀器有數顯恒溫水浴鍋(HH－8國華電器有限公司)，真空旋轉蒸發儀(N^－1000D上海愛朗儀器有限公司)，MAXI－DRY LYO真空凍干機(Heto－Holten，基因有限公司代理)，電熱鼓風干燥箱(湖北省黃石醫療器械廠)，紫外可見分光光度計(WFZ800－D3B北京瑞利分析儀器公司)，嘉仕特多功能攪拌機(廣東省南海市南莊良樂電器廠)#65377;

1．2試驗方法

1．2．1南瓜多糖的提取采用熱水提取法#65377;取適量鮮南瓜洗凈#65380;晾干#65380;磨碎#65380;過60目篩#65377;取100 _g南瓜干粉于70℃提取數小時，趁熱過濾，取水提液，重復3次#65377;合并水提液并濃縮至原體積的1/4，加入3倍量95%乙醇溶液，離心，取沉淀#65377;將沉淀加適量的雙蒸水使之溶解，減壓濃縮后即為南瓜多糖濃縮液#65377;

1．2．2蛋白質含量的測定[4] 粗多糖濃縮液中蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法#65377;以牛血清蛋白作標準曲線#65377;

1．2．3多糖含量的測定[5] 粗多糖濃縮液中多糖含量的測定采用蒽酮－硫酸法#65377;以葡萄糖作標準曲線#65377;

1．2．4脫蛋白方法的比較脫蛋白質較為常用的方法是Sevag法，用氯仿#65380;正丁醇按4∶1比例混和，加至樣品中搖勻，樣品中的蛋白質和混和液形成凝膠，可用離心除去#65377;脫蛋白還可使用酚#65380;三氯乙酸#65380;重金屬鹽等試劑，但同時應該注意避免多糖的降解#65377;近年來己經有人嘗試用三氯乙酸#65380;木瓜蛋白酶+Sevag法進行多糖中蛋白的去除，獲得較好的效果[6－9]#65377;在本試驗中采用3種不同的方法分別對南瓜粗多糖進行脫除蛋白的比較#65377;

1)三氯乙酸法脫除蛋白2 mol·L^－1三氯乙酸

分別滴加不同量到5 mL南瓜多糖濃縮液中，各試樣中三氯乙酸溶液加入體積依次為50#65380;100#65380;150#65380;200#65380;250#65380;300#65380;350#65380;400#65380;450#65380;500#65380;550#65380;600 μL#65377;混勻后4℃下靜置4 h，8 000 r·min·^－1離心10 min后測定上清液的糖濃度和蛋白質濃度#65377;

2)Sevag法脫除蛋白 根據蛋白質在氯仿等溶劑中變性的特點按南瓜多糖濃縮液和有機溶劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)5∶1混合，劇烈振蕩20 min，離心去除沉淀，取上清液，再加入上述比例的有機溶劑，重復8次#65377;每次測定上清液的糖濃度和蛋白質濃度#65377;

3)重金屬離子沉淀法脫除蛋白 硫酸銅溶液2 mol·L^－1，分別滴加不同量到5 mL南瓜多糖濃縮液中，各試樣中硫酸銅溶液加入體積依次為0#65380;50#65380;100#65380;150#65380;200#65380;250#65380;300#65380;350#65380;400和450 μL#65377;混勻后4℃靜置4 h，8 000 r·min·^－1離心10 min^－1后測定上清液的糖濃度和蛋白質濃度#65377;

2結果與分析

2．1三氯乙酸法脫除蛋白的結果

三氯乙酸作為一種有機酸，可以使樣品溶液中的蛋白質因為有機酸作用而變性沉淀#65377;如圖1所示，當加入不同濃度的三氯乙酸時，南瓜多糖提取液中的蛋白含量也隨之變化，加入600 μL時，上清液的蛋白質已經基本上被去除完畢，可以看出隨著加入三氯乙酸溶液量的增加，糖濃度也呈明顯的下降趨勢，可能是糖鏈被三氯乙酸降解所致#65377;

2．2Sevag法脫除蛋白的結果

如圖2所示，利用Sevag法除蛋白可以取得較好的效果，加入Sevag試劑，反復脫蛋白5次，可以獲得較好的脫蛋白效果，而且此方法比較溫和，提取液中的糖濃度下降的比較緩慢#65377;但當脫蛋白超過5次后，提取液中的糖濃度下降加快，所以采用此方法脫蛋白，確定合適的脫蛋白次數尤為重要#65377;

2．3硫酸銅離子法脫除蛋白的結果

重金屬離子可以使得溶液中的蛋白質因為變性而沉淀，從而除去提取液中的雜蛋白#65377;從圖3可以看出，隨著銅離子加入量的增加，蛋白質可以比較完全去除，同時由上清液中的糖濃度的變化來看，對糖濃度的影響也比較小#65377;

2．43種方法去除蛋白的效果比較

3種方法脫蛋白的效果比較見圖4#65377;由圖4可見，3種方法當加入量達到一定比例時，蛋白脫除效果均較好，其蛋白質去除率均可以達到80%以上#65377;采用三氯乙酸法脫蛋白時，多糖損失

較大，而采用Sevag法脫蛋白和重金屬離子沉淀除蛋白不但脫蛋白效果好，多糖損失也較小，這兩種方法更適用于脫除水溶性南瓜多糖蛋白#65377;

3討論

1)脫除蛋白是獲得南瓜粗多糖過程中的一個

重要步驟，本研究中我們對比了3種常用的脫蛋白方法—Sevag法#65380;三氯乙酸(TCA)法和硫酸銅法的脫除效果，3種方法均能較好的脫除蛋白，但對于多糖結構及活性有著不同程度的影響#65377;其中三氯乙酸作用劇烈，如果用量過多會導致多糖中糖鏈的斷裂，活性物質的降解#65377;從試驗結果我們可以看出，隨著三氯乙酸用量的增加，提取液中多糖含量下降較快，所以此法不太適合南瓜多糖蛋白的去除#65377;

2)Sevag法是公認的脫除蛋白最經典的方法，此方法比較溫和，雖然一次效率不高，需要反復操作，但對糖鏈的影響較小，此法不僅可以脫除蛋白，還有除去部分色素的作用，因此一般在未知多糖結構的情況下，宜采用此法脫除多糖蛋白#65377;

3)硫酸銅離子法脫除蛋白的原理是利用重金屬離子使溶液中的蛋白質因變性而沉淀，從而除去提取液中的雜蛋白#65377;此方法可以很好的脫除蛋白，但考慮到銅離子是多種反應的催化劑，如催化維生素C產生過氧化氫和羥基自由基等，而老南瓜維生素C含量較高，這對多糖的生物活性檢測有一定的影響，所以在南瓜多糖的提取中不宜使用#65377;

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