大豆胚芽尖再生體系的建立及轉(zhuǎn)基因初步研究

(1．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽110161；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081；

3．農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程，北京100081)

摘要：建立了吉林小粒1號(hào)的胚芽尖再生體系，對(duì)胚芽尖#65380;子葉節(jié)#65380;胚軸作為外植體的重生芽發(fā)生頻率及主要影響因素進(jìn)行了比較#65377;結(jié)果表明，胚芽尖重生芽發(fā)生頻率高，再生時(shí)間短，對(duì)卡那霉素敏感，合適的篩選濃度為100 mg·L^－1#65377;以吉林小粒1號(hào)胚芽尖為外植體，將植物表達(dá)載體w10通過農(nóng)桿菌(LBA4404)導(dǎo)入吉林小粒1號(hào)，在農(nóng)桿菌中孵育6 h，篩選培養(yǎng)基上重生芽發(fā)生頻率高，成功獲得了再生植株#65377;

關(guān)鍵詞：大豆組培；胚芽尖；子葉節(jié)；胚軸

中圖分類號(hào)：S565．1；Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439－8114(2008)06－0615－04

A Pilot Study of An Soybeans Embryonic Tip Regeneration System

SUN Wen－li1，2，3，LIU Yu－h(huán)ui2，3，WU Yuan－h(huán)ua1，F(xiàn)U Jun－fan1

(1．Plant Pathology Department， Shenyang Agriculture University， Shenyang 110161，China；

2．Biotechnology Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China；

3．Important Scientific Engineerings of Crops Gene Resources and Gene Improvement of China，Beijing 100081，China)

Abstract： In order to improve the quality of Jilinxiao No．1，the embryonic tip regeneration system was set up according to the method of Wei－Zhi－ming． The differences of the multiple shoot frequency amang embryonic tip， cotyledonary node and hypocotyl segment was compared with statistic analytical method． The result indicatd that embryonic tip had the highest frequency multiple shoot and the shortest time to get it． The embryonic tip was sensitive to kanamycin and the suitable concentration was 100 mg·L^－1． The high frequency multiple shoot could be gained when the embryonic tip was incubated in LBA4404 for 6 h． The regeneration plants of Jilinxiaoli1 transformed the w10 with the embryonic tip by LBA4404 were obtained．

Key words： soybean tissue culture； embryonic tip； cotyledonary node； hypocotyl segment

建立一個(gè)良好的組培再生系統(tǒng)，是大豆遺傳轉(zhuǎn)化成功的前提#65377;目前研究再生頻率比較高的再生體系有子葉節(jié)#65380;胚軸和胚芽尖[1，2]#65377;由于子葉節(jié)具有取材不受季節(jié)限制#65380;誘導(dǎo)再生快#65380;轉(zhuǎn)化突變率低等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用#65377;Zhou等[3－8]用子葉節(jié)為受體分別將幾丁質(zhì)酶基因#65380;Bt基因#65380;玉米轉(zhuǎn)座子Ac基因，SMV－CP基因等轉(zhuǎn)入Peking等大豆品種中#65377;但也存在再生頻率低#65380;受基因型限制#65380;轉(zhuǎn)化株的嵌合體等問題#65377;胚軸作為外植體，是目前研究應(yīng)用較多的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化受體，有許多成功的轉(zhuǎn)化事例#65377;早在1983年陳云昭等就以大豆上胚軸和下胚軸為外植體培養(yǎng)出再生植株[9]#65377;徐香玲等[4，5]和蘇彥等[7]分別將Bt基因，SMV－CP基因#65380;幾丁質(zhì)酶基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以胚軸為受體轉(zhuǎn)入吉林29和中黃4號(hào)等品種中，但其仍然存在誘導(dǎo)再生植株頻率低#65380;重復(fù)性差#65380;轉(zhuǎn)化效率低等缺點(diǎn)#65377;胚芽尖作為大豆組培外植體是由Liu等[10]2004年首次研究報(bào)道的#65377;Liu等[10]用大豆胚芽尖#65380;胚軸#65380;子葉節(jié)分別作為外植體進(jìn)行GUS基因的遺傳轉(zhuǎn)化#65377;發(fā)現(xiàn)胚芽尖的重生芽發(fā)生效率達(dá)到87．7%，而子葉節(jié)和胚軸分別為40．3%和56．4%#65377;并且胚芽尖利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以得到15%的轉(zhuǎn)化效率，是一個(gè)新的具有高轉(zhuǎn)化效率的再生體系[10]#65377;目前還沒有其他關(guān)于胚芽尖再生系統(tǒng)的報(bào)道，也沒有關(guān)于大豆品種吉林小粒1號(hào)組培體系的報(bào)道#65377;

為了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)有效地提高吉林小粒1號(hào)的品質(zhì)性狀，本研究選用大豆品種吉林小粒1號(hào)為試驗(yàn)材料建立胚芽尖再生體系，并對(duì)以上3種再生體系在各種影響因素下的重生芽發(fā)生頻率進(jìn)行了比較，期望為吉林小粒1號(hào)品質(zhì)性狀的改良提供轉(zhuǎn)化平臺(tái)，并對(duì)大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高提供新的依據(jù)#65377;

1材料與方法

1．1試驗(yàn)材料

大豆品種吉林小粒1號(hào)(由國家種質(zhì)資源中心提供)#65377;

1．2外植體的準(zhǔn)備

在超凈臺(tái)中先用75%的酒精處理1~2 min，然后用次氯酸鈉(80%無菌水+20%次氯酸鈉)消毒40 min，無菌水沖洗4~6次，再用無菌水浸泡3 h后，把水倒掉，放在濾紙上吸干#65377;

胚芽尖：將消毒好的種子放在MSB5(表1)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)到MSB5(0．2 mg·L^－1 6－BA，0．2 mg·L^－1 IBA)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~10 d#65377;取上述無菌苗，切除子葉和第1片葉子，得到暴露的胚芽尖分生組織，作為外植體備用#65377;

子葉節(jié)：將消毒好的種子，放在1/2MSB5(1 mg·L^－1 BAP和100 μmol·L^－1乙酰丁香酮)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，沿水平方向?qū)⒆尤~下的胚軸切開(大約離子葉下3~5 mm)備用#65377;

胚軸：種子滅菌后，放到MSB5(1．0 mg·L^－1 BAP)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d，將上胚軸(大約1 cm長(zhǎng))從種子上切離下來備用#65377;

1．33種外植體重生芽頻率比較

由于再生頻率是大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系重要因素#65377;因此，我們對(duì)大豆吉林小粒1號(hào)，分別利用胚芽尖#65380;子葉節(jié)#65380;胚軸3種再生體系進(jìn)行再生，每種外植體取樣100，分裝15皿#65377;統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)有3個(gè)或以上重生芽的愈傷數(shù)量，與總的愈傷數(shù)量比較，計(jì)算重生芽頻率，取3次重復(fù)平均值#65377;

1．43種外植體重生芽發(fā)生時(shí)間比較

我們對(duì)大豆吉林小粒1號(hào)胚芽尖#65380;子葉節(jié)#65380;胚軸3種轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了再生時(shí)間的比較，每種外植體取樣100，分裝15皿，分別于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)5#65380;10#65380;15#65380;20#65380;25 d時(shí)進(jìn)行大于3個(gè)重生芽的外植體數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與總的外植體數(shù)量比較，計(jì)算重生芽頻率，取3次重復(fù)平均值#65377;

1．5吉林小粒1號(hào)胚芽尖再生體系的建立

參考Wei等的方法，將胚芽尖外植體放在MSB5培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，將胚芽尖向上插入MSB5(6 mg·L^－1 BAP和100 μmol·L^－1乙酰丁香酮)培養(yǎng)基中，25℃光照18 h/黑暗6 h，培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基1次，待重生芽長(zhǎng)到2~3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基1/2MSB5(0．2 mg·L^－1 BAP，1．0 mg·L^－1 IBA)上，16 h光照/8h黑暗，培養(yǎng)至長(zhǎng)成植株，正常光照培養(yǎng)[10]#65377;

1．63種外植體卡那霉素篩選濃度的確定

卡那霉素(Kanamycin)是組培中常用的篩選指標(biāo)，濃度過低引起假陽性增加后期檢測(cè)的工作量，浪費(fèi)成本#65377;而濃度過高，則再生頻率低#65377;為此，我們將胚芽尖#65380;子葉節(jié)#65380;胚軸3種外植體重生芽再生培養(yǎng)基的Kanamycin篩選濃度設(shè)定為10#65380;20#65380;30#65380;40#65380;50#65380;70#65380;80#65380;100 mg·L^－1，3周后統(tǒng)計(jì)大于3個(gè)重生芽的外植體數(shù)量，與總的外植體數(shù)量比較，計(jì)算重生芽頻率，取3次重復(fù)平均值#65377;

1．7不同侵染時(shí)間對(duì)胚芽尖重生芽頻率的影響

將含有植物表達(dá)載體w10的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB+K中培養(yǎng)過夜#65377;在50 mLYEB培養(yǎng)基中重培養(yǎng)至OD600達(dá)1．3~1．5#65377;3 000 r·min^－1離心10 min，菌體用1/2MSB5洗1次，用1/2MSB5(3 mg·L^－1 BAP和100 μmol·L^－1乙酰丁香酮)，調(diào)整OD600至0．5#65377;

將胚芽尖外植體放在含有3%蔗糖#65380;0．6%植物凝膠和3．5 mg·L^－1 BAP的MSB5培養(yǎng)基上24 h#65377;外植體放入農(nóng)桿菌的懸液中分別孵化0．5#65380;1．0#65380;1．5#65380;3．0#65380;6．0#65380;12．0 h，每個(gè)時(shí)間段孵化外植體60個(gè)，分別將其放在6皿鋪有濾紙的1/2MSB5(6 mg·L^－1 BAP 和 100 μmol·L^－1乙酰丁香酮)培養(yǎng)基上(pH值5．8)，25℃，黑暗培養(yǎng)5 d#65377;外植體轉(zhuǎn)移到含0．6%植物凝膠的固體培養(yǎng)基上1/2MSB5(0．2 mg·L^－1 BAP，0．2 mg·L^－1 IBA，300 mg·L^－1噻孢)放置5～7 d#65377;然后，將外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基1/2MSB5(0．2 mg·L^－1 BAP， 0．2 mg·L^－1 IBA，300 mg·L^－1噻孢，300 mg·L^－1羧芐，100 mg·L^－1卡那)上光照培養(yǎng)，兩周后統(tǒng)計(jì)大于3個(gè)重生芽的外植體數(shù)量，與總的外植體數(shù)量比較，計(jì)算重生芽頻率，重復(fù)3次取平均值#65377;

1．8農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化吉林小粒1號(hào)再生植株的獲得

方法同1．7(將外植體放入農(nóng)桿菌懸液中孵化

6 h)，待抗性芽長(zhǎng)到2~3cm時(shí)，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上1/2MSB5(0．2 mg·L^－1 BAP，1．0 mg·L^－1 IBA，300 mg·L^－1噻孢，300 mg·L^－1羧芐，25 mg·L^－1卡那)16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)至長(zhǎng)成植株，正常光照培養(yǎng)#65377;

2結(jié)果與分析

2．13種外植體重生芽頻率比較

大豆吉林小粒1號(hào)3種外植體重生芽頻率的比較結(jié)果見圖1#65377;由結(jié)果我們可以得知胚芽尖的重生芽頻率最高達(dá)到95%，子葉節(jié)的重生芽頻率其次為81%，胚軸的重生芽頻率相對(duì)較低為78%#65377;這說明對(duì)于大豆品種吉林小粒1號(hào)而言外植體的重生芽頻率胚芽尖>子葉節(jié)>胚軸#65377;

2．23種外植體重生芽發(fā)生時(shí)間比較

能夠快速產(chǎn)生重生芽也是好的再生體系的一個(gè)評(píng)價(jià)因素#65377;因此我們對(duì)吉林小粒1號(hào)，3種外植體的重生芽發(fā)生時(shí)間進(jìn)行比較(表2)，結(jié)果表明胚芽尖重生芽發(fā)生頻率達(dá)到最高的時(shí)間出現(xiàn)在15 d左右，而子葉節(jié)和胚軸均出現(xiàn)在25 d左右，這說明胚芽尖的重生芽發(fā)生時(shí)間較短，優(yōu)于子葉節(jié)和胚軸#65377;

2．3吉林小粒1號(hào)胚芽尖再生體系的建立

利用胚芽尖作為外植體，在MSB5培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入MSB5(6 mg·L^－1 BAP和100 μmol·L^－1 乙酰丁香酮)培養(yǎng)基中，15 d左右成功獲得了大豆品種吉林小粒1號(hào)的重生芽，將重生芽轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基1/2MSB5(0．2 mg·L^－1 BAP，1．0 mg·L^－1 IBA)上，15 d左右開始生根(圖2)，1個(gè)月左右全部生根，將生根的再生苗打開瓶口煉苗3 d后，洗去根部培養(yǎng)基，移栽到盆中長(zhǎng)成植株#65377;

2．43種外植體卡那霉素篩選濃度的確定

3種外植體重生芽再生培養(yǎng)基的Kanamycin篩選濃度設(shè)定為10#65380;20#65380;30#65380;40#65380;50#65380;70#65380;80#65380;100 mg·L^－1，

3周后統(tǒng)計(jì)重生芽數(shù)量結(jié)果見表3#65377;表3結(jié)果表明，Kanamycin濃度達(dá)到80 mg·L^－1時(shí)，3種外植體重生芽數(shù)量均為0，因此，我們認(rèn)為100 mg·L^－1為合適的Kanamycin篩選濃度#65377;

2．5不同侵染時(shí)間對(duì)胚芽尖體系重生芽發(fā)生頻率的影響

不同侵染時(shí)間對(duì)胚芽尖外植體的重生芽發(fā)生頻率影響不同，結(jié)果(表4)表明，吉林小粒1號(hào)胚芽尖隨著侵染時(shí)間的不同而在抗性培養(yǎng)基上重生芽發(fā)生頻率不同，最適侵染時(shí)間為6 h#65377;

2．6吉林小粒1號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的獲得

我們利用農(nóng)桿菌(LBA4404)侵染法將w10(帶有植物抗病基因)導(dǎo)入大豆品種吉林小粒1號(hào)，得到再生植株86棵(圖3)，經(jīng)初步鑒定得到轉(zhuǎn)基因陽性植株#65377;初期轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀態(tài)與非轉(zhuǎn)基因植株相同，隨著大豆生育期的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸表現(xiàn)差異，有的偏矮或葉片偏小，也得到了部分長(zhǎng)勢(shì)良好且與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辙r(nóng)藝性狀相同的植株，為下一步研究轉(zhuǎn)入基因的功能打下了基礎(chǔ)#65377;

3結(jié)論與討論

本研究以大豆胚芽尖為外植體，在MSB5加入6 mg·L^－1 BAP和100 μmol·L^－1乙酰丁香酮，以及1/2MSB5加入0．2 mg·L^－1 BAP和1．0 mg·L^－1 IBA培養(yǎng)基上，建立了高效快速的吉林小粒1號(hào)大豆組培再生體系#65377;并利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體w10轉(zhuǎn)化吉林小粒1號(hào)，獲得了再生植株#65377;同時(shí)，對(duì)吉林小粒1號(hào)的胚芽尖#65380;子葉節(jié)#65380;胚軸3種外植體在再生頻率#65380;再生時(shí)間#65380;Kanamycin篩選濃度，農(nóng)桿菌不同侵染時(shí)間對(duì)重生芽再生頻率的影響進(jìn)行了研究#65377;結(jié)果表明，吉林小粒1號(hào)重生芽再生頻率胚芽尖>子葉節(jié)>胚軸；再生時(shí)間胚芽尖優(yōu)于子葉節(jié)和胚軸；Kanamycin最適篩選濃度為100 mg·L^－1；最適農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為6 h#65377;

胚芽尖作為大豆遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，目前研究報(bào)道比較少#65377;Liu等[10]2004年的研究表明，胚芽尖外植體再生頻率高#65380;再生時(shí)間短#65380;對(duì)卡那敏感，我們的研究結(jié)果與之相符，進(jìn)一步證明了胚芽尖再生體系相對(duì)于子葉節(jié)和胚軸再生系統(tǒng)的優(yōu)越性#65377;Liu等[10]試驗(yàn)顯示胚芽尖再生系統(tǒng)農(nóng)桿菌最適侵染時(shí)間為20 h，而我們研究表明最適農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為6 h，這可能是由于不同的基因型對(duì)大豆組培的影響造成的#65377;大豆組培再生體系受不同的基因型，不同的外植體#65380;不同的激素濃度#65380;不同的培養(yǎng)基等諸多因素的影響，這也增加了大豆再生體系優(yōu)化的復(fù)雜性和困難性#65377;我們的研究為胚芽尖再生系統(tǒng)在再生時(shí)間和再生頻率上相對(duì)于子葉節(jié)和胚軸再生系統(tǒng)的優(yōu)越性提供了新的試驗(yàn)依據(jù)，首次為吉林小粒1號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化建立了再生體系，為進(jìn)一步優(yōu)化吉林小粒1號(hào)組培體系打下了研究基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)其他基因型的大豆遺傳轉(zhuǎn)化具有借鑒意義#65377;

致謝：感謝國家種質(zhì)資源中心邱麗娟博士提供大豆吉林小粒1號(hào)種子#65377;

參考文獻(xiàn)：

[1]HINCHEE M A W， CONNOR－WARD D V， NEWELL C A， et al． Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium－mediated DNA transfer[J]． Biotechnology， 1988，6：915－922．

[2]OLHOFT P M，SOMERS D A． L－Cysteine increases Agrobacterium－mediated T－DNA delivery into soybean cotyledonarynode cells[J]． Plant Cell Rep．， 2001，20：706－711．

[3]ZHOU J H， ATHERLY A G． In situ detection of transposition of the maize controlling element (Ac) in transgenic soybean tissues[J]． Plant Cell Reports，1990，8：542－545．

[4]徐香玲，李興華，劉偉華，等． Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的大豆花葉病毒外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化大豆的研究[J]． 大豆科學(xué)，1996，15(4)：279－288．

[5]徐香玲，鄒聯(lián)沛，劉偉華． 向大豆導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶的初步研究[J]．大豆科學(xué)，1999，18(2)：101^－108．

[6]徐香玲，高晶，劉偉華，等． Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的Bt k－內(nèi)毒素蛋白基因轉(zhuǎn)化大豆的初步研究． 大豆科學(xué)，1997，16(1)：6^－11．

[7]蘇彥輝，王慧麗，俞梅敏，等． 蘇云金芽孢桿菌殺蟲品體蛋白基因?qū)氪蠖沟难芯縖J]．植物學(xué)報(bào)，1999，41(10)：1046^－1051．

[8]周思軍，李希臣，劉昭軍，等． 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt(cryIA)基因?qū)氪蠖筟J]．大豆科學(xué)，2001，20(3)：157^－162．

[9]陳云昭，王玉國．大豆外植體培養(yǎng)再生植株的研究[J]．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1983(1)：41－45．

[10]LIU H K， YANG C， WEI Z M． Efficient Agrobacterium tumefaciens －mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system[J]． Planta， 2004，219： 1042^－1049．