歐文氏桿菌ＣＸＪＺ１１－０１基因組文庫的構建

(中國農業科學院麻類研究所，長沙410205)

摘要：采用改良鳥槍法構建了草本纖維精制高效菌種CXJZ11－01的基因組文庫，通過透明圈法篩選到了2個木聚糖酶基因陽性克隆#65377;

關鍵詞：歐文氏桿菌CXJZ11－01；，基因組文庫；木聚糖酶基因

中圖分類號：Q939．121；Q78文章標識碼：A文章編號：0439－8114(2008)06－0619－03

Genomic Library Construction of Erwinia carotovora CXJZ11－01

SHI Jun，LIU Zheng－chu，CHENG Li－feng，DUAN Sheng－wen，ZHENG Ke，FENG Xiang－yuan，HU Zhen－xiu

(Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China)

Abstract：By using shot－gun method，the genomic DNA library of the efficient herbaceous extraction strain E．carotovora CXJZ11－01 was constructed．Using the method of transparent circle to the positive clones， theidentical xylanase genes was identified．

Key words： E．carotovora CXJZ11－01；genomic library；xylanase gene

木聚糖是半纖維素的主要成分之一，是自然界中僅次于纖維素的第二大生物質資源[1]#65377;木聚糖酶是木聚糖的專一降解酶，屬于水解酶類，包括內切木聚糖酶#65380;外切木聚糖酶和木糖苷酶3種#65377;木聚糖酶主要來源于微生物，可產木聚糖酶的微生物主要有：細菌[2，3]#65380;放線菌[4，5]#65380;真菌(包括鏈霉菌)[5]和酵母菌等[6－8]#65377;國內研究最多的是木霉菌株T6#65380;青霉#65380;黑曲霉#65380;棒曲霉#65377;20世紀70年代末有許多國家開展了木聚糖酶基因克隆的研究，目的在于提高微生物分泌木聚糖酶的表達量#65377;Bernier[9]等從Bacillus Subrilis PAPII5中克隆到第1個木聚糖酶基因以來，至今已經有近百種不同微生物來源的菌株的木聚糖酶基因被克隆，并在大腸桿菌及酵母等各種宿主菌種中表達[10]#65377;盡管國外已有許多來自真菌和細菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達的報道，但真正用于木聚糖酶生產的基因工程菌株還不是太多#65377;本研究通過建立歐文氏桿菌CXJZ11－01基因組文庫，采用透明圈法[11]，篩選木聚糖酶基因陽性克隆，克隆和研究該菌種木聚糖酶基因#65377;

1材料與方法

1．1材料

歐文氏桿菌CXJZ11－01#65380;E．coli DH5a及載體pUC18由本實室保存#65377;Lambda Hind－III Fragment， DNA DL2，000 Marker，10×GC Buffer，dNTPs，r－TaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司#65377;E．Z．N．A Plasmid Miniprep Kit II，E．Z．N．A Gel Extraction Kit，購自Omega公司#65377;木聚糖購自Sigma公司#65377;其他試劑均為國產分析純#65377;引物由上海生工合成#65377;

1．2方法

1．2．1菌種的培養挑取保存菌種涂平板，35℃過夜培養，挑選典型菌落接種至LB培養基，35℃擴大培養6 h左右，取少量接種至發酵培養基或直接作為研究材料#65377;

1．2．2歐文氏桿菌CXJZ11－01基因組DNA提取培養5 mL細菌培養物至飽和，取1．5 mL培養物離心2 min，沉淀物加567 μL的TE緩沖液重懸#65377;加30 μL 10%SDS和3 μL 20 mg·mL^－1的蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1 h，加100 μL 5 mol·L^－1 NaCl，充分混勻，再加80 μLCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃溫浴10 min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，離心4~5 min，留上清，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心5 min，留上清，加入0．6倍體積異戊醇，輕輕混合到DNA沉淀下來，用1 mL70%乙醇洗滌，離心5 min，棄上清，稍干燥DNA，重新溶于100 μL TE緩沖液中#65377;

1．2．3基因組DNA的酶切首先選用Sap Ι，MboΙ，Sau3A Ι，DpnⅡ，MseΙ，進行限制性酶切，然后選定酶切效果最好的Sau3A I梯度酶切，確定最適酶用量#65377;

1．2．4基因組DNA的連接轉化制備載體pUC18#65377;采用OMEGA試劑盒E．Z．N．A Plasmid Miniprep Kit II提取，按實驗操作手冊進行#65377;加入BamH I，酶切過夜，用E．Z．N．A Gel Extraction Kit 凝膠回收，按實驗操作手冊進行，然后采用CIAP去磷酸化30 min，醋酸—無水乙醇沉淀法去雜回收，然后溶于適量雙蒸水或TE中，－20℃保存#65377;加入DNA連接酶，將酶切后的DNA片斷與載體16℃連接過夜#65377;

1．2．5基因文庫的構建采用鈣激法制備大腸桿菌感受態細胞，通過藍白斑篩選重組子，構建了歐文氏桿菌變異菌株CXJZ11－01的基因文庫，甘油保存#65377;將白色重組子用牙簽轉移在產木聚糖酶菌株的選擇培養基上，37℃恒溫箱培養2~3 d后，碘液染色，結果發現有菌落周圍出現了清晰的透明圈，篩選到陽性克隆#65377;采用PCR方法對陽性克隆進行了進一步的分析鑒定#65377;

2結果與分析

2．1基因組DNA的提取

通過CTAB法抽提基因組DNA，提取的歐文氏桿菌CXJZ11－01基因組DNA的大小不到20 kb，在UNICAM核酸蛋白儀上測得紫外吸收值，A260/A280=1．802，A260/A230=2．069#65377;由此獲得了高分子量且純度高的歐文氏桿菌變異菌株CXJZ11－01基因組DNA，可以保證隨機酶切片斷上所含的基因是完整的，符合基因建庫的要求#65377;

2．2基因組DNA的酶切

獲得純化的基因組DNA后，用Sap Ι，MboΙ，Sau3A I，DpnⅡ，MseΙ進行限制性酶切，獲得酶切片段的電泳結果表明，所采用的各種工具酶都能將CXJZ11－01基因組DNA切開，而且片段大小幾乎都在500～5 000 bp之間#65377;鑒于Sau3A I的識別位點是4個核苷酸，對基因組DNA進行部分酶切能產生合適的DNA片段，其末端具有與載體相匹配的粘性末端，可與BamH I酶切過的pUC18質粒連接，轉化到E．coli DH5a中，初步選定Sau3A I為本研究的工具酶進行梯度酶切#65377;利用紫外分光光度計對提取的基因組DNA進行定量分析，確定基因組DNA濃度#65377;取150 μL基因組DNA(約10μg)，加入20 μL 10×Sau3A I酶切緩沖液，補充ddH2O至200 μL，形成溶液A#65377;然后取10個Eppendorf管，進行梯度酶切試驗(表1)，最后得到優化酶切體系為最適酶用量0．031U·μg^－1 DNA(圖1)，酶切時間20 min，能使酶切片段集中在1～5kb之間#65377;

2．3基因組DNA的連接轉化

分別設置不同基因組DNA#65380;載體的濃度和體積，經過反復試驗，獲得優化連接體系技術參數如表2所示#65377;設計不同濃度和體積的插入片斷與pUC18載體進行連接轉化試驗，獲得插入片斷與pUC18載體摩爾比為4∶1時連接效率較高#65377;

2．4基因文庫構建

因為不帶質粒的大腸桿菌在含有Amp的LB培養基上不生長，空載質粒導入大腸桿菌以后在該培養基上表現為藍色菌落，只有插入了目的基因的質粒轉化到大腸桿菌后，其菌落才表

現為白色，所以，根據同一平板上藍#65380;白斑的數量和比例可以計算出轉化率#65377;按照1．2．4基因組DNA的連接轉化描述的方法連接成“pUC18－木聚糖酶基因DNA片段”，并轉化到受體“大腸桿菌感受態細胞”中，通過藍白斑篩選，得知其轉化率為65%，重組子為2．3×104個#65377;這些重組子就構成了歐文氏桿菌變異菌株CXJZ11－01的基因文庫(圖2)#65377;

用牙簽將所得歐文氏桿菌變異菌株CXJZ11－01的基因文庫的重組子轉移在產木聚糖酶菌株選擇培養基(課題組多年實踐經驗已經證明該培養基具有功能鑒定的惟一性)上，37℃恒溫箱培養2~3 d后，碘液染色，結果發現有菌落周圍出現了清晰的透明圈(圖3)，篩選到3個陽性克隆，將得到的上述陽性克隆重新接種到篩選培養基中進行鑒定，結果發現有2個陽性克隆仍然能在接代培養基中產生透明圈#65377;因此，可以肯定，本研究已經成功地構建出了歐文氏桿菌變異菌株CXJZ11－01基因文庫#65377;

3結論與討論

一般來說，構建基因文庫的難點之一是獲得高分子量以及高純度的外源DNA，這樣酶解后才能產生合適大小的DNA片斷，且片斷兩端都有相應的粘性末端與載體相連，以獲得完整的基因文庫#65377;難點之二是連接轉化的效率#65377;難度之三是重組子的篩選與鑒定#65377;本研究可以得出如下結論：①采用CTAB法抽提基因組DNA時，異戊醇提前冰浴將有利于DNA沉淀，電泳存在RNA污染時用RNase處理，紫外吸收比值A260/A280在1．70^－1．90間時，DNA純度符合基因建庫要求#65377;②確定了插入片斷與pUC18載體合適的摩爾比為4∶1時連接效率較高，此外將載體采用CIAP去磷酸化，也是提高重組效率的關鍵#65377;③優化了酶切體系和連接轉化體系，直接回收合適大小的酶切產物進行轉化，將酶切片斷盡可能集中在1~5kb，避免了不含完整目的基因的過短DNA片斷以及不易轉化的過長DNA片斷，不僅提高了轉化率，而且無需亞克隆篩選測序#65377;④成功構建了歐文氏桿菌CXJZ11－01木聚糖酶功能基因組文庫，為歐文氏桿菌CXJZ11－01其他功能基因組如甘露聚糖酶基因，果膠酶基因的克隆奠定了基礎#65377;

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