降解秸稈纖維素絲狀真菌的分離鑒定

(咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，湖北 咸寧437100)

摘要：經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩從腐爛的秸稈中分離出的8株產(chǎn)纖維素酶的真菌中獲得1株高效降解秸稈纖維素的絲狀真菌g76，經(jīng)菌株形態(tài)分析和18S rRNA基因序列分析，確定該菌株為Gibberella fujikuroi，以天然水稻秸稈為惟一碳源，37℃搖瓶培養(yǎng)120 h，所得粗酶液作用于CMC—Na#65380;水稻秸稈#65380;濾紙#65380;木聚糖等不同底物，其酶活可分別達(dá)1．722 67 IU·mL^－1(Cx酶)#65380;0．368 13 IU·mL^－1(Cx酶)#65380;0．344 24 IU·mL^－1(FPase)#65380;0．531 78 IU·mL^－1(半纖維素酶)#65377;

關(guān)鍵詞：秸稈纖維素；絲狀真菌；酶活；鑒定

中圖分類號(hào)：Q949．32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439－8114(2008)06－0652－03

Isolation and Identification of Straw Cellulose－biodegrading Filamentous fungi

ZENGQing－lan

(Department of Biological Engineering，Xianning Vocational Technical College，Xianning 43700，Hubei，China)

Abstract： Eight fungi producing cellulases were screened and isolated from cankered straw． One of them which can biodegrade straw cellulose effectly was selected and named _g76． It was identified as _gibberella fujikuroi by the analysis of morphologic taxonomy and 18S rRNA _gene sequences． The activity of CMCase(1．722 67 IU·mL^－1，0．368 13 IU·mL^－1) ，F(xiàn)Pase (0．344 24 IU·mL^－1)， hemicellulase (0．531 78IU·mL^－1) were obtained via crude enzyme’s action with CMC－Na，rice straw ，filter paper，xylan．The crude enzyme was obtained by flask solid state fermentation with natural straw as only carbon source，at 37℃ for 120 h．

Key words： straw cellulose； Filamentous fungi； cellulase activity； identification

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈約5．7億t以上，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%[1]，如果其中一半加以利用，則可產(chǎn)生酒精5 000億t以上[2]，由此可見(jiàn)，秸稈纖維素的這種潛在價(jià)值是不可估量的#65377;而不斷地分離和選育高效纖維素降解菌，是將秸稈纖維素潛在價(jià)值轉(zhuǎn)化為現(xiàn)實(shí)價(jià)值的關(guān)鍵，是一項(xiàng)重要而有意義的工作#65377;目前的研究表明真菌分解纖維素的能力比細(xì)菌強(qiáng)[3]，真菌在分解纖維素底物時(shí)，菌絲穿過(guò)次生壁進(jìn)入胞腔，由內(nèi)而外降解纖維素，使其分解成可被利用的雙糖或單糖#65377;我們基于獲取優(yōu)良纖維素降解菌株的目的，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選，從腐爛的秸稈中篩選到一株高效降解秸稈纖維素的絲狀真菌，該菌能產(chǎn)生高效纖維素酶未曾見(jiàn)任何報(bào)道，它在運(yùn)用于農(nóng)作物秸稈等不溶碳源的微生物轉(zhuǎn)化方面有較好的前景#65377;

1材料與方法

1．1材料

1)腐爛的秸稈取自湖北武漢#65380;咸寧#65377;

2)培養(yǎng)基羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC培養(yǎng)基)[4]：NaCl 6 _g，MgSO₄·7H₂O 0．1 _g，KH₂PO₄ 0．5 _g，CaCl₂ 0．1 _g，K₂HPO₄ 2．0 _g，CMC－Na 15 _g，(NH₄)₂SO₄ 2．0 _g，蒸餾水1 000 mL pH值7．0～7．4；固體培養(yǎng)基加1．5%瓊脂#65377;馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖1 _g，蛋白胨0．5 _g，KH2PO4·3H2O 0．1 _g，MgSO4·7H2O 0．05 _g，0．1%孟加拉紅溶液0．33 mL，瓊脂1．5 _g，蒸餾水100 mL，自然pH值，2%去氧膽酸鈉溶液2 mL(預(yù)先滅菌，臨用前加入)，鏈霉素溶液(10 000U·mL^－1)0．33 mL(臨用前加入)#65377;PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 _g，蔗糖20 _g，瓊脂15 _g，蒸餾水1 000 mL#65377;

1．2方法

1．2．1固體培養(yǎng)篩選

1)產(chǎn)纖維素酶的菌株的獲取將采集到的含菌的腐爛秸稈經(jīng)無(wú)菌水洗滌后，吸取洗滌上清液以10^－1#65380;10^－2#65380;10^－3#65380;10^－4#65380;10^－5#65380;10^－6等梯度稀釋，將稀釋液涂布在選擇培養(yǎng)基羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d；從培養(yǎng)基上挑取單菌落于CMC固體培養(yǎng)基上劃線分離純化，獲得的菌株分別轉(zhuǎn)接于CMC平板上，28℃再培養(yǎng)2 d，用剛果紅染色后，再用NaCl脫色，選擇出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株作為下一步研究的對(duì)象#65377;

2)細(xì)菌#65380;真菌的分離將篩選獲得的產(chǎn)纖維素酶的菌株接種到馬丁培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2 d，能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的即為真菌#65377;

1．2．2搖瓶發(fā)酵復(fù)篩將篩選到的真菌菌株進(jìn)行搖瓶液體培養(yǎng)，測(cè)定纖維素酶酶活，用3，5－二硝基水楊酸法(DNS法)測(cè)定還原糖，通過(guò)還原糖量的多少代表纖維素內(nèi)切酶活力的高低，反映菌株纖維素酶總酶活的強(qiáng)弱，選擇酶活高的菌株保藏備用#65377;

1．2．3還原糖的測(cè)定采用3，5－二硝基水楊酸法(DNS法)[5]

1．2．4酶活測(cè)定方法

1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取1 mg·mL^－1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0#65380;0．2#65380;0．4#65380;0．6#65380;0．8#65380;1．0#65380;1．2#65380;1．4#65380;1．6#65380;1．8 mL于10支刻度試管中，加入DNS1．5 mL煮沸5 min，迅速冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至20 mL，在520 nm波長(zhǎng)下，以1號(hào)試管溶液作為空白對(duì)照，調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定其他各管溶液的光密度值(OD值)并記錄結(jié)果#65377;以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)#65377;

2)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取1 mg·mL^－1木糖標(biāo)準(zhǔn)液0#65380;0．2#65380;0．4#65380;0．6#65380;0．8#65380;1．0#65380;1．2 mL于7支刻度試管中，加入DNS1．5 mL煮沸5 min，迅速冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至20 mL，在550 nm波長(zhǎng)下，以1號(hào)試管溶液作為空白對(duì)照，調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定其他各管溶液的光密度值(OD值)并記錄結(jié)果#65377;以木糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)#65377;

3)內(nèi)切葡聚糖酶(Cx酶)活力測(cè)定[6]用CMC酶活力代表內(nèi)切酶活，取1．5 mL 0．05 mol·L^－1醋酸緩沖液配制的1．0%羧甲基纖維素鈉溶液，加入0．2 mL經(jīng)5 000 r·min^－1離心10 min所得的發(fā)酵液上清液，50℃反應(yīng)20 min#65377;用DNS法測(cè)定反應(yīng)后還原糖(葡萄糖)含量，同時(shí)做空白對(duì)照扣除本底#65377;酶活定義為上述條件下，1 mL發(fā)酵液1 min催化底物生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位“IU”#65377;

4)濾紙酶(FPA)活力測(cè)定將新華1號(hào)濾紙(1cm×6cm)用1%的醋酸溶液浸泡一晝夜除去淀粉，用碘液檢驗(yàn)，再用2%的NaHCO3溶液洗至中性，曬干后卷成小卷，放進(jìn)試管內(nèi)，加入1．5mL HAC－Na AC緩沖液(pH值4．8)，再加入0．5 mL酶液，輕輕搖勻，使濾紙浸泡在液體中；在50℃溫度下保溫30 min后，按DNS法測(cè)定還原糖(葡萄糖)#65377;以國(guó)際單位為依據(jù)，定義1 min催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位“IU”#65377;

5)天然纖維素酶活力測(cè)定稱取堿處理過(guò)的水稻秸稈粉0．1 _g，加入4 mL 0．05 mol·L^－1醋酸緩沖液和2 mL發(fā)酵液的上清液， 50℃保溫2 h后按DNS法測(cè)定還原糖(葡萄糖)，酶活定義同濾紙酶#65377;

6)半纖維素酶活力測(cè)定取1．5 mL 0．05 mol·L^－1醋酸緩沖液緩沖液配制的1．0%木聚糖溶液，加入0．1 mL經(jīng)5 000 r·min^－1離心10min所得的發(fā)酵液的上清液，50℃反應(yīng)20 min#65377;用DNS法測(cè)定反應(yīng)后還原糖含量，定義1mL發(fā)酵液1min催化底物水解生成1 μmol還原糖(以木糖計(jì))的酶量為一個(gè)酶活力單位“IU”#65377;

1．3菌種鑒定

1．3．1形態(tài)分析[7]分別在CMY和PDA平板上劃線接種，28℃培養(yǎng)，連續(xù)幾天觀察菌落外觀形態(tài)#65380;顏色#65380;菌絲生長(zhǎng)情況等，顯微鏡觀察菌絲體#65380;分生孢子形態(tài)等進(jìn)行分類鑒定#65377;

1．3．218S rRNA基因分析

1)DNA提取取培養(yǎng)12 h的菌絲體4 mL，離心去水相，加400 μL 1%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，離心后棄上清液，加入細(xì)胞裂解液(4 mol·L^－1鹽酸胍，0．1 mol·L^－1 Tris－Cl，pH值7．5)400 μL，室溫孵育30min，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)的，混勻后于12 000 r·min^－1下離心5 min，收集上清液于離心管中，加入等體積的氯仿，混勻離心，取上清液，加2倍體積無(wú)水乙醇和1/10體積醋酸鈉(3 mol·L^－1，pH值5．2)緩慢倒置混勻后于－20℃冰箱中靜置40 min以沉淀DNA，12 000 r·min^－1下離心5 min，棄去上清液，得到的沉淀DNA加入70%乙醇混勻后同前法離心，棄去上清液，DNA沉淀于37℃下干燥10min以去除殘留乙醇，用超純水溶解沉淀后，于－20℃冰箱中保存待用#65377;

2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增[8]得到的DNA模板用真菌核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物(5′—TCC TCC _gCT TAT TGA TAT _gC—3′和5′—GGA _gAT AGT CGT AAC AAG _g—3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 所有PCR反應(yīng)均在50μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中進(jìn)行， 其中含5 μL緩沖液(100 mmol·L^－1 Tris－Cl，15 mmol·L^－1 MgCl2，500 mmol·L^－1 KCl，pH值8．3)，1 μmol·L^－1混合dNTPs，每一引物均為20 pmol·L^－1，1UTaq酶，1 μL模板DNA，加無(wú)菌超純水(Milli－Q)至50 μL，于PCR儀上按94℃預(yù)變性3 min，然后按94℃#65380;30 s，56℃#65380;40 s，72℃#65380;1 min，循環(huán)32次，最后72℃延伸10 min#65377;

3)擴(kuò)增產(chǎn)物的純化采用上海申能博彩生物科技有限公司提供的3S Spin DNA Agarose _gel Purification Kit對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的DNA用超純水溶解，獲得的純化DNA用于下一步測(cè)序#65377;

4)18SrDNA序列測(cè)定純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司測(cè)序#65377;

2結(jié)果與分析

2．1菌種篩選

通過(guò)固體培養(yǎng)初篩，獲得降解纖維素的真菌8株#65377;將8株真菌菌株置于28℃環(huán)境中搖瓶發(fā)酵2 d后測(cè)定纖維素酶活進(jìn)行復(fù)篩，所測(cè)得的8株真菌的CMC酶活的結(jié)果見(jiàn)表1，其中1株初始編號(hào)為g76的菌株在pH值4．8的條件下的內(nèi)切酶活力高于其他產(chǎn)纖維素酶的真菌，因而選用它進(jìn)行進(jìn)一步的研究#65377;

2．2菌種鑒定

2．2．1形態(tài)觀察 _g76在CMC培養(yǎng)基表面氣生菌絲呈白色迅速蔓延，；具有不規(guī)則分生孢子梗，產(chǎn)生大量白色小球狀分生孢子，分生孢子有大小兩型：大者為鐮刀形#65380;紡錘形#65380;棍棒形#65380;線形等，壁薄而透明，一般分3～6隔；小者為橢圓形#65380;紡錘形#65380;卵形#65380;梨形或臘腸形，透明，無(wú)隔或有1～2隔，菌絲體在培養(yǎng)基淺層伸展，在PDA培養(yǎng)基表面上氣生菌絲呈絮狀蔓延#65377;有時(shí)在菌落中央產(chǎn)粉紅色或粉紅色至肉桂色的黏孢團(tuán)，其中含大量小型和大型分生孢子#65377;菌落背面為淡黃色#65377;初步鑒定g76為子囊菌亞門#65380;核菌綱#65380;球殼菌目#65380;肉座菌科#65380;赤霉屬的種類#65377;

2．2．218SrRNA基因分析經(jīng)北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)，該菌株與子囊菌亞門#65380;核菌綱#65380;球殼菌目#65380;肉座菌科#65380;赤霉屬的Gibberella fujikuroi的18SrDNA序列有99%的同源性，結(jié)合形態(tài)觀察，初步確定該菌為藤倉(cāng)赤霉#65377;

2．3菌種酶活

將該絲狀真菌接種到以未經(jīng)化學(xué)處理的水稻秸稈為惟一碳源的液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培養(yǎng)5 d，測(cè)定粗酶液與不同底物作用產(chǎn)生的酶活(表2)，結(jié)果表明該菌對(duì)不同底物都有較強(qiáng)的作用力#65377;

3結(jié)論

采用羧甲基纖維素鈉平板進(jìn)行菌種分離，用剛果紅染色#65380;NaCl脫色初篩，搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩，篩選出一株纖維素酶活性較高的絲狀真菌#65377;經(jīng)形態(tài)分析和18SrRNA基因序列分析，確定該菌株為Gibberella fujikuroi，該絲狀真菌能產(chǎn)生高效纖維素酶未見(jiàn)報(bào)道#65377;以天然水稻秸稈為惟一碳源，37℃液體搖瓶培養(yǎng)5 d，所得粗酶液作用于CMC—Na#65380;水稻秸稈#65380;濾紙#65380;木聚糖等不同底物，其酶活可分別達(dá)1．722 67 IU·mL^－1(Cx酶)#65380;0．368 13 IU·mL^－1(Cx酶)#65380;0．344 24 IU·mL^－1(FPase)#65380;0．531 78 IU·mL^－1(半纖維素酶)，表明該菌對(duì)不同的底物作用力均較強(qiáng)，尤其是它對(duì)不溶性纖維素所表現(xiàn)出的較高的降解能力，顯示其在利用農(nóng)作物秸稈等不溶碳源#65380;變廢為寶上有很大的潛力#65377;

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