一株耐受高濃度重金屬離子細菌的分離及初步鑒定

(1．江蘇省工業生物技術創新中心，南京210009；2．南京工業大學制藥與生命科學學院，南京210009；

3．華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室，武漢430070)

摘要：從武漢市鋼鐵廠排污口污泥中分離到1株耐受高濃度重金屬離子的細菌，命名為CD－02#65377;通過形態學觀察#65380;生理生化試驗以及16S rDNA序列分析，將該細菌鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)#65377;P． putida CD－02對多種二價重金屬離子具有非凡的抗性，對于本試驗所測試的7種二價金屬離子，該菌株的最大耐受濃度(MTC)均超過了5 mmol·L^－1，因此菌株CD－02是研究細菌重金屬抗性機制非常好的材料#65377;

關鍵詞：重金屬；惡臭假單胞菌；MTC；16S rDNA

中圖分類號：Q939．96文獻標識碼：A文章編號：0439－8114(2008)06－0655－04

Isolation and Characterization of One Bacterial Strain Tolerated High Concentrations Metal Ions

HU Nan1，2，ZHAO Shu－miao3， ZHAO Bin3，LI Shuang1，2， XIAO Ai－hua1，2，HUANG He1，2

(1．Jiangsu Provincial Innovation Center for Industrial Biotenology， Nangjing 210009， China；

2．College of Pharmacy and Life Science， Nanjing University of Technology， Nanjing 210009， China；

3．State Key Laboratory of Agricultural Microorganism， Huazhong Agriculture University， Wuhan 430070， China)

Abstract： A strain tolerated heavy metals with high concentrations， named CD－02， has been isolated from the sewage sludge samples collected in Wuhan Steel Factory． Through the observation of morphological， a series of physiological－biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis， strain CD－02 was identified as Pseudomonas putida． P． putida CD－02 exhibited extraordinary resistance to a large spectrum of divalent metals， and MTCs of seven divalent metal ions used in this work all exceeded 5 mmol·L^－1，so strain CD－02 could be a very suitable strain for researching the metal－resistant mechanisms of bacteria．

Key words：heavy－metals；Pseudomonas putida；MTC；16S rDNA

重金屬作為一種持久性微量毒害物，能在環境中日趨積累，很容易通過食物鏈在生物體內富集，并能抑制甚至破壞生物體內關鍵酶的活性[1]，對人類及其他生物的生存構成了嚴重威脅#65377;據環保總局不完全調查，我國耕地已有五分之一以上受到了重金屬污染，全國每年因重金屬污染的糧食達1 200萬t，由此造成的經濟損失達數百億元[2]，因此對重金屬的治理迫在眉睫#65377;

目前治理重金屬污染，對于廢水而言，主要采用離子交換#65380;化學沉淀#65380;溶劑提取等傳統的物理化學方法[3]；而對土壤重金屬污染的治理只能依靠排土#65380;客土和深耕翻土，利用酸性化學物質或某些螯合劑增加土壤重金屬的移動性，以及利用植物凈化土壤的重金屬[4]#65377;這些方法費用高#65380;周期長#65380;都不能大規模實施#65377;尋找適于經濟發展需要和生態環境要求的治理途徑，成為一項亟待解決的問題#65377;

近年來，重金屬污染的微生物修復技術受到了國內外專家學者的廣泛關注#65377;微生物通過表面吸附#65380;胞內沉淀以及成礦作用[5]來降低重金屬離子的移動性；有些微生物能夠利用氧化還原作用改變重金屬離子的化合價或通過甲基化#65380;去甲基化作用[6]，來減弱重金屬離子的毒性；還有一些微生物能夠分泌出與重金屬離子緊密結合的蛋白[7]，形成不易被植物和動物吸收金屬離子－蛋白質的復合體，進而一定程度上控制了重金屬離子在食物鏈中的流動#65377;

目前關于重金屬抗性細菌的報道大部分集中在產堿桿菌#65380;大腸桿菌#65380;金黃色葡萄球菌等少數的幾類細菌里[8，9]#65377;因此，本試驗希望從環境中分離出對重金屬具有高耐受性的細菌，并通過傳統與分子的方法鑒定這些細菌，進而為研究其重金屬抗性機制以及開展微生物治理重金屬污染提供優質的微生物資源#65377;

1材料與方法

1．1材料

1．1．1菌株及培養條件Pseudomonas putida CD－02，從武漢鋼鐵廠排污口分離，牛肉膏蛋白胨或者LB培養基28℃培養；Escherichia coli DH5α，本實驗室保存，LB培養基37 ℃培養#65377;

1．1．2本試驗所使用的重金屬鹽及其保存濃度(表1)

1．2方法

1．2．1重金屬最大耐受濃度(MTC值)的測定重金屬的最大耐受濃度(Maximal tolerant concentration，MTC)是指細菌對某一重金屬離子的耐受臨界濃度，MTC值越高，代表細菌對這種金屬的耐受能力也越強#65377;具體測定方法：挑取菌株CD－02的單菌落，接種至液體LB，28℃培養至對數生長期，然后將培養好的菌液劃線接種到一系列包含不同濃度的某種金屬離子的LB平板上，28℃培養4 d，如果在某個濃度只能細微地觀察到菌株CD－02的生長，并且在略微高于這個濃度的平板上觀察不到菌株CD－02的生長，這一濃度便是菌株CD－02對這種金屬的最大耐受濃度(MTC[10]#65377;

1．2．2生理生化試驗生理生化試驗包括運動性觀察#65380;氧化酶試驗#65380;接觸酶試驗等等，所有的試驗方法與步驟參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[11]#65377;

1．2．3總DNA樣本的提取活化菌株CD－02至對數期，離心收集1．5 mL菌體，用STE緩沖液洗滌，然后用0．5 mL高濃度的TE緩沖液懸浮，充分混合均勻后，加溶菌酶至0．5 mg·mL^－1，37℃保溫60 min#65377;加入10% SDS至終濃度1%，反復倒轉離心管使菌體裂解，加5 mol·L^－1 NaCl至終濃度為1 mol·L^－1并混勻，37℃保溫至菌液透明#65377;等體積苯酚－氯仿提取，至有機相與水相界面無蛋白為止#65377;吸取上清，用2倍體積預冷的無水乙醇沉淀，總DNA沉淀溶解在低濃度TE中，－20℃保存#65377;

1．2．416S rDNA片段的擴增首先小量制備菌株CD－02的總DNA樣本#65377;根據真細菌16S rDNA的高度保守區段選擇引物，對全長的16S rDNA片段分兩段進行擴增[12]#65377;PCR反應的復性溫度為33℃#65377;兩對引物分別如下：

引物對1：5′－TACCTTGTTACGACTT－3′，5′－ ATTAGATACCCTDGTAGTCC－3′

引物對2：5′－GGACTACHAGGGTATCTAAT－3′，5′－AGAGTTTGATCMTGG－3′

2結果與分析

2．1重金屬抗性菌株的分離

重金屬抗性菌株的篩選是以高濃度鎘離子作為篩子的，稱取10 _g從武漢鋼鐵廠排污口采集的污泥樣本，加入到一盛有90 mL滅菌水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩使其均勻分散，然后按10倍稀釋法梯度稀釋直至10－4，對每個稀釋度分別吸取100 μL懸液，均勻涂抹在含2 mmol·L^－1鎘離子的牛肉膏蛋白胨平板上，28℃倒置培養48 h，僅10^－1的稀釋度出現了5個單菌落，命名為CD－01～CD－05#65377;綜合比較了這5個菌株對多種重金屬的抗性能力，最后選取了抗性最高的CD－02菌株作為研究菌株開展后續試驗#65377;

2．2形態學觀察結果

在LB平板上劃線分離單菌落，在解剖鏡下觀察菌落形態，28℃培養24 h后形成1．5 mm大小的菌落，邊緣整齊#65380;濕潤#65380;突起#65377;革蘭氏染色后，鏡檢觀察到菌株CD－02為革蘭氏陰性細菌，菌體形狀為桿狀(圖1)#65377;

2．3生理生化試驗結果

對菌株CD－02選擇性地進行了大量的生理生化試驗，結果如表2所示#65377;參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》上關于陰性細菌的描述來分析試驗結果，發現該菌只能與惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的特征完全吻合，因此初步將菌株CD－02鑒定為惡臭假單胞菌，隨后我們將P． putida CD－02與本室保存的另一株標準菌株P． putida KT 2440進行了幾個重要的生理生化試驗的比較，發現結果依然是一致的#65377;

2．416S rDNA序列分析

為了更加精確的鑒定菌株CD－02，對其16S rDNA的序列進行了分析#65377;首先，抽提菌株CD－02的總DNA，以該總DNA為模板#65380;16S rDNA通用引物作為引物，對16S rDNA片段分成兩段進行PCR擴增(圖2)#65377;電泳回收擴增產物，T載體連接轉化大腸桿菌，抽提重組質粒送至上海華諾基因測序公司測定16S rDNA序列，最后將測定的序列在核苷酸數據庫中進行BLAST分析#65377;比對結果顯示菌株CD－02的16S rDNA序列(EMBL登錄號：AM930519)與Pseudomonas putida的16S rDNA序列高度同源，其中與菌株Pseudomonas putida KT2440的同源性最高，僅有一個堿基的差別#65377;綜合生理生化試驗的結果，將菌株CD－02鑒定為Pseudomonas putida#65377;

2．5最大重金屬耐受濃度(MTC值)的測定結果

目前有兩種方法來評價細菌對重金屬的耐受能力#65377;一種是測定最小抑制生長濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，金屬離子濃度超過了MIC值時，細菌的生長將受到抑制；另一種方法是測定最大耐受濃度(Maximal tolerant concentration， MTC)，這是細菌對某種金屬離子的極限耐受濃度#65377;因此MTC值應遠大于MIC值，本試驗采用了MTC值來評價細菌細胞的重金屬抗性能力#65377;本試驗對7種二價金屬離子的MTC值進行了測定，測定結果如圖3，Pseudomonas putida CD－02對所有7種金屬離子體現出了極高的耐受性，耐受濃度依次為：

Mn²⁺(45mmol·L^－1)>Zn²⁺(12．8mmol·L^－1)>Co²⁺(11．6mmol·L^－1)>Ni²⁺(8．5 mmol·L^－1)>Cu²⁺(8．2 mmol·L^－1)>Cd²⁺(7．3 mmol·L^－1)>Pb²⁺(7．2 mmol·L^－1)#65377;

2．6抗藥性試驗結果

假單胞菌的多個菌屬在分類上相距很遠，因而藥敏也有很大的差異#65377;一般說來，通常對卡那霉素和丁胺卡那霉素敏感，而對各種青霉素類抗生素通常耐藥，對復方新諾明#65380;慶大霉素#65380;新生霉素#65380;四環素及頭孢霉素的敏感性因種和菌株而不同#65377;為了后續試驗更加便利地開展，我們簡單對Pseudomonas putida CD－02的抗藥性進行了分析(表3)，發現它對氨芐青霉素和慶大霉素不敏感#65377;

3討論

本試驗從武漢鋼鐵廠的排污口分離到了多株耐受高濃度重金屬離子的細菌，經過簡單的革蘭氏染色試驗，發現這些細菌都為陰性細菌，這表明了革蘭氏陰性細菌在重金屬耐受能力上可能要優于革蘭氏陽性細菌#65377;

就我們所知，在同樣的培養條件下，P． putida CD－02的MTC值明顯地高于文獻中報道的許多其他菌株的MTC值[8，9]，因此P． putida CD－02的重金屬抗性機制是非常值得我們進一步的去研究的#65377;

我們利用原子吸收光譜檢測了菌株的重金屬離子吸附能力，發現P． putida CD－02幾乎不能有效的吸附重金屬離子#65377;那它是以一種怎樣的機制去抵御如此高濃度的重金屬離子，是阻止重金屬離子進入細胞，還是存在高效率的蛋白系統不斷地排出進入細胞的重金屬離子，接下來我們將繼續進行試驗去解釋這個問題#65377;

通過小質粒快檢以及大質粒電泳均沒有在P． putida CD－02中檢測到質粒存在，因此重金屬的抗性基因應位于染色體上，這也增大了我們克隆抗性基因#65380;闡明抗性機制的難度#65377;目前我們正在構建菌株的突變體庫，整體分析P． putida CD－02基因組中與重金屬抗性相關的基因#65377;相信P． putida CD－02中重金屬的抗性機制一定會被研究透徹，這將會給重金屬污染的微生物治理提供更多的技術支持#65380;帶來更多新的思考#65377;

參考文獻：

[1]BANJERDKIJ P， VATTANAVIBOON P，MONGKOLSUK S． Exposure to cadmium elevates expression of _genes in the OxyR and OhrR regulons and induces cross－resistance to peroxide killing treatment in Xanthomonas campestris [J]． Appl Environ Microbiol， 2005，71：1843^－1849．

[2]王敬中．我國每年因重金屬污染糧食達1200萬噸 [J]． 農村實用技術，2006(11)：30．

[3]孟多，周立岱，于常武． 水體重金屬的處理 [J]． 遼寧化工，2006(9)：534－536．

[4]王英輝，祁士華，陳學軍．金屬礦山廢棄地重金屬污染的植物修復治理技術[J]．中國礦業， 2006(10)：67－71．

[5]MALIK A． Metal bioremediation through _growing cells [J]． Environ Int，2004，30：261－278．

[6]BARKAY T， MILLER S M， SUMMERS A O． Bacterial mercury resistance from atoms to ecosystems [J]． FEMS Microbiol Rev，2003，27(2－3)：355－384．

[7]VASAK M． Advances in metallothionein structure and functions [J]． J Trace Elem Med Biol，2005，19(1)：13^－17．

[8]Nies D H． Efflux－mediated heavy metal resistance in prokaryotes [J]． FEMS Microbiol， 2003，27：313－339．

[9]Silver S． Bacterial resistances to toxic metal ions－a review [J]． _gene，1996，179(1)：9^－19．

[10]HASSAN M T， VAN DER LELIE D， SPRINGAEL D， et al． Identification of a _gene cluster， czr， involved in cadmium and zinc resistance in Pseudomonas aeruginosa [J]． _gene， 2003，238：417－425．

[11]BLAKEMORE R P， BLAKEMORE N A， BAZYLINSKI D A， et al． Berjey’s Manual of Systematic Bacteriology [M]． Baltimore M D： Williams and Wilkins，1989．

[12]WILSON K H， BLITCHINGTON R B， _gREENE R C．

Amplification of Bacterial 16S Ribosomal DNA with Polymerase Chain Reaction [J]． J Clin Microbiol，2000，28：1942^－1946．