拮抗鏈霉菌Ｈ２１０發酵液抗菌譜及理化性質

(1．沈陽農業大學植物保護學院，沈陽110161；2．山西省農業科學院植物保護研究所，太原030031)

摘要：菌株H210發酵液抑菌活性生測結果表明，其對煙草野火病菌#65380;煙草角斑病菌和水稻白葉枯病菌等病原細菌的抑菌效果明顯，抑菌圈直徑分別為43 mm#65380;42．5 mm和37．4 mm；對瓜果腐霉病菌#65380;辣椒炭疽病菌#65380;煙草赤星病菌#65380;番茄灰霉病菌等病原真菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑均在20 mm以上#65377;其發酵液的理化性質測定表明，該菌株對紫外線#65380;光照#65380;酸和堿均有較好的穩定性；繼代培養5代后抑菌活性基本無變化，遺傳特性穩定；發酵液經60℃溫度處理3 h，抑菌活性基本未受影響，但經80℃處理時隨時間延長抑菌活性明顯下降#65377;

關鍵詞：鏈霉菌；發酵液；抗菌譜；穩定性

中圖分類號：S476．1文獻標識碼：B文章編號：0439－8114(2008)06－0668－03

Study on Antagonistic Spectrum and Stability of Streptomyces Strain H210

ZHANG Xiao－wen1，GAO Fen2，WEI Ying－ying1，ZHAO Xiu－xiang1，WU Yuan－hua1

(1 College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China

2 Institute of Plant Protection， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan 030031，China)

Abstract：H210 was isolated from soil samples， which had inhibition against 5 pathogenic bacteria such as Pseudomonas syringae pv．tabaci and Xanthomonas oryzae pv． oryzae． The diameters of inhibition zone were 43mm and 37．4mm respectively； The results also showed that the diameters of inhibition zone against 14 pathogens， such as Pythium aphanidermatum f．sp．melonis， Colletotrichum capsici， Alternaria alternata， Botrytis cinerea were more than 20mm． The physiological and chemical characteristics of the fermented broth were studied， and the results indicated that it was stable to subculture， UV， light， acid and alkali． Its activity was stable at 60℃ ，but sensitive at 80℃

Key words： Streptomyces spp．；fermentated broth；antagonistic spectrum；stability

作物細菌性病害是當前病害防治的難點，常造成嚴重損失，如水稻白葉枯病#65380;煙草野火病#65380;煙草角斑病#65380;煙草青枯病#65380;大白菜軟腐病等都是近幾年在我國發病比較嚴重的細菌性病害#65377;目前防治細菌病害的藥劑種類缺少，化學藥劑主要有氯溴異氰尿酸#65380;噻菌銅#65380;氧氯化銅#65380;氧化亞銅#65380;二元酸銅#65380;絡氨銅等，但防效不理想；生物農藥中僅有農用鏈霉素#65380;中生菌素#65380;新植霉素等少數幾種制劑在生產上應用[1－2]#65377;因此，加強針對細菌性病害的農用抗生素的研發具有很好的應用前景#65377;

本實驗室以病原細菌煙草野火病菌#65380;水稻白葉枯病菌為靶標篩選出的拮抗鏈霉菌H210，在室內活性測定中表現出了良好的抑菌活性，本文對其發酵液的抗菌譜及理化性質進行了初步研究，報道如下#65377;

1材料與方法

1．1供試菌株

拮抗菌：菌株H210，由本實驗室從土壤中分離#65380;篩選，初步鑒定為鏈霉菌屬(Streptomyces spp． H210)#65377;其他病原菌均由沈陽農業大學植物保護學院病毒與基因工程研究室提供#65377;

靶標菌：煙草野火病菌(Pseudomonas syringae pv．tabaci)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv． oryzae)#65377;

1．2發酵液的制備

發酵培養基：淀粉47 _g，花生粉22 _g，酵母粉2 _g，(NH4)2SO4 2．7 _g，CaCO3 2．7 _g，NaCl 2．7 _g，水1 000 mL，pH值7．2#65377;發酵時用250 mL三角瓶裝樣量50 mL#65377;

拮抗菌培養：菌株H210接種于高氏一號培養基斜面上，28℃恒溫培養4 d，待用#65377;

發酵方法：按接種量8%～10%(V/V)接種，孢子濃度為(105～106cfu·mL^－1)，恒溫震蕩培養(28℃#65380;180～190 r·min^－1)4 d，發酵液6 000 r·mim^－1離心15 min，取上清液過細菌過濾器去除菌體，得到發酵液無菌濾液，用于下面各項試驗#65377;

1．3抑菌活性及抗菌譜的測定

1．3．1拮抗鏈霉菌的活體抑菌活性活體抑菌活性測定采用瓊脂塊法[3－4]#65377;將鏈霉菌孢子制成混懸液并涂布平板，28℃恒溫培養5～7 d后，制備菌餅(直徑7 mm)#65377;將煙草野火病菌菌懸液(2×107～3×107cfu·mL^－1)0．7 mL，水稻白葉枯病菌菌懸液(3×107～4×107cfu·mL^－1)0．7 mL加到70 mL 50℃左右的NA培養基中，制成混菌平板，放置拮抗菌菌餅，28℃恒溫培養24 h后十字交叉法測量抑菌圈直徑#65377;試驗設3次重復#65377;

1．3．2拮抗鏈霉菌發酵液的抑菌活性發酵液抑菌活性測定采用管碟法[5－6]#65377;同1．3．1制備混菌平板，等距離放置無菌牛津杯，加入發酵液200 μL，28℃恒溫培養24 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑#65377;試驗設3次重復#65377;

1．3．3發酵液的抗菌譜測定將各類病原菌分別制成混菌平板，冷卻后放入牛津杯，加發酵液200 μL，28℃恒溫培養，真菌48 h#65380;細菌24 h后測量抑菌圈直徑#65377;

1．4發酵液理化性質的測定

1．4．1熱穩定性測定試驗設3個處理：將菌株發酵原液于60#65380;80#65380;100℃水浴下分別處理0．5#65380;1#65380;2#65380;3 h后，各取出1 mL自然冷卻，以原始發酵液為對照，管碟法測定生物活性#65377;

1．4．2對紫外光和光照穩定性的測定在無菌培養皿中加入等量發酵液，置于紫外線(λ2537?魡，距離15 cm)下分別照射1#65380;2#65380;4 h；置于裝有8只30W日光燈的光照培養箱中，分別照射3#65380;6#65380;12 h后取樣測定生物活性#65377;

1．4．3酸#65380;堿穩定性的測定取10份樣品，每份10 mL發酵液，用1 mol·L^－1 HCl和1 mol·L^－1 NaOH分別調pH值2～11，然后將每份調好的樣品分裝試管，測定其抑菌活性#65377;

1．4．4遺傳穩定性測定將菌株原始純化菌作為F1代，繼代培養至F5代，每代培養5～6 d，將1～5代的菌株常規發酵，測定發酵液抑菌活性#65377;

2結果與分析

2．1發酵液抑菌活性及抗菌譜的測定結果

2．1．1拮抗鏈霉菌活體和發酵液的抑菌活性菌株H210活體的抑菌試驗表明：該菌株的活體對病原細菌有明顯的抑菌活性，對靶標菌煙草野火病菌#65380;水稻白葉枯病菌活體抑菌圈直徑分別為25．0 mm和24．2 mm；發酵液的無菌濾液也有明顯的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為41．7 mm和38．6 mm，重復發酵后抑菌效果穩定#65377;

2．1．2發酵液的抗菌譜測定菌株H210發酵液的抗菌譜較廣#65377;在病原細菌中，對煙草角斑病菌#65380;煙草野火病菌抑菌圈直徑分別為42．5 mm和43．0 mm；對煙草青枯病菌#65380;水稻白葉枯病菌抑菌圈直徑都在30 mm以上#65377;在病原真菌中，對瓜果腐霉病菌的抑菌圈直徑最大，為42．0 mm，其次是辣椒炭疽病菌，為38．0 mm#65377;另外，對煙草赤星病菌#65380;番茄灰霉病菌#65380;小麥赤霉病菌#65380;辣椒根腐病菌#65380;香瓜枯萎病菌#65380;水稻惡苗病菌的抑菌效果也較好，抑菌圈直徑均在30 mm以上(表1)#65377;

2．2發酵液理化性質的測定結果

2．2．1熱穩定性測定熱穩定性試驗結果表明，菌株H210熱穩定性一般#65377;在60℃下處理，隨加熱時間延長，抑菌圈開始減小，但不明顯；在80℃下處理時，抑菌活性遞減明顯，處理到3 h時，抑菌圈直徑降為25．3 mm，與對照相比，抑菌活性降低了39．8%；100℃處理時，抑菌活性顯著降低，3 h后抑菌活性基本喪失(圖1)#65377;

2．2．2紫外光及自然光照射下的穩定性測定菌株H210的發酵液經紫外光和自然光照射后，抑菌活性均下降不明顯，表現出了對紫外光和自然光良好的穩定性(圖2#65380;圖3)#65377;

2．2．3酸堿的穩定性測定菌株H210的發酵液在中性#65380;酸性條件下較穩定，當pH=6～7時，抑菌活性最高，堿性條件下抑菌圈直徑略有下降，但下降不明顯(表2)#65377;

2．2．4遺傳穩定性測定菌株H210經連續5次傳代培養后，其發酵液的抑菌活性變化不明顯，抑菌圈直徑分別為42．6#65380;42．0#65380;41．8#65380;41．5和41．3 mm，第5代的抑菌圈直徑比出發菌株的直徑只減少1．3 mm，僅下降3．1%，說明其遺傳特性穩定#65377;

3小結與討論

1)生物農藥的開發是目前植物保護領域的研究熱點之一，但用于防治細菌性病害的生防制劑的開發少見報道#65377;本實驗室篩選得到的菌株H210的發酵液在室內平皿試驗中表現出了良好的抑菌效果，且抗菌譜廣，尤其是對病原細菌表現出了顯著的抑制作用#65377;發酵液理化性質的測定結果表明，該菌株對紫外線#65380;酸堿等不良環境條件耐受性較好，遺傳特性也較為穩定#65377;盡管其對高溫敏感，但可以通過誘變等途徑進行改良，從而進行進一步的開發應用研究#65377;

2)本文抗菌譜測定中所選用的供試病原真菌和病原細菌種類有限，尚需擴大研究#65377;另外，其田間藥效還需要進一步驗證#65377;

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