兔抗ＩＶＭ多克隆抗體的制備

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/中國農業科學院新獸藥重點開放實驗室，蘭州730050)

摘要：將伊維菌素(IVM)進行化學修飾，引入羧基活性基團，合成具有半抗原結構特征的伊維菌素半琥珀酸酯(IVM－HS)；然后采用NHS法和混合酸酐法將半抗原與聚－L－賴氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA)相偶聯，制備人工免疫原(PLL－IVM－HS)和包被原(OVA－IVM－HS)；經凝膠電泳鑒定，用人工免疫原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體(pAb)，間接ELISA測定其效價#65377;結果人工免疫原偶聯成功，分子結合比為25．3∶1，獲得了高價#65380;敏感#65380;特異性的IVM pAb，為IVM殘留免疫學檢測法的建立奠定了基礎#65377;

關鍵詞：伊維菌素；半抗原；人工免疫原；多克隆抗體

中圖分類號：S859．79+5；S852．4+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439－8114(2008)06－0685－03

The Preparation of Polyclone Antibody for Indirect Competitive ELISA of IvermectinResidue

WEI Xiao－juan，ZHANG Ji－yu，ZHANG Mei，LI Jian－yong，ZHOU Xu－zheng，LI Jin－shan，NIU Jian－rong

(Lanzhou Institute of Animal and Veterinary Pharmaceutics Sciences/ The Key Laboratory of New Animal Drug of Chinese Academy of Agricutural Sciences _gansu，Lanzhou 730050，China)

Abstract： The active _group carboxyl was introduced to Ivermectin (IVM) and formed IVM half succinaate (IVM－HS) which had hapten structure by chemical modification． The method of NHS was used to conjugate IVM－HS to PLL and obtained artificial immunogen PLL－IVM－HS， the coating antigen OVA－IVM－HS was obtained by mixed anhydride reaction method． SDS－PAGE was used to identify PLL－IVM－HS． New zealand white rabbits were immunized with PLL－IVM－HS， the titre of polyclonal antibody(pAb) was detected by indirect ELISA． The results showed that PLL－IVM－HS had been synthesized successfully and its conjugation ratio of IVM－HS to PLL was about 25．3∶1， the high－titer， sensitive and specific IVM pAb had been produced in sera of immunized new zealand white rabbits． This made it possible to establish immunoassay of IVM residues in feed and animal food．

Key words： ivermectin； hapten； artificial immunogen； polyclonal antibody

伊維菌素(Ivermectin，IVM)是大環內酯類抗寄生蟲藥物，由于其具有活性強#65380;殺蟲譜廣等優點，已被廣泛地應用在畜禽及水產養殖業上，并且也是農業生產上廣泛使用的一種農業殺蟲劑，還在醫學臨床上廣泛應用于皮膚病的治療[1，2]#65377;但是此類藥物在動物性食品中的殘留可能會對人及環境產生潛在的危害，同時也嚴重影響我國農產品的國際競爭力#65377;傳統的HPLC法因其操作過程復雜#65380;費時#65380;檢測成本高，嚴重限制了其在實際操作中的可用性#65377;由于IVM的使用劑量很小，組織中藥物最高殘留限量為15～20 ng·g^－1，因而對IVM殘留的檢測十分困難#65377;隨著人們對IVM殘留的毒性及環境風險的日益關注，急需更科學#65380;快捷和高效的檢測手段#65377;因此，開發一種簡單#65380;快速#65380;適用現場監控的痕量分析方法具有重要的現實意義#65377;本文在人工抗原合成和鑒定的基礎上，擬制備高效價的多克隆抗體，用于IVM的免疫化學分析研究，以期為開發具有自主知識產權的試劑盒奠定基礎#65377;

1材料與方法

1．1材料

1．1．1試驗動物健康新西蘭大白兔，體重約2 kg，由中牧集團蘭州生物制藥廠提供#65377;

1．1．2主要試劑聚－L－賴氨酸(PLL)#65380;卵清蛋白(OVA)#65380;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(Sigma公司)；羊抗兔IgG－HRP(華美生物工程公司)；酶聯免疫吸附測定(ELISA)中所用的試劑均為國產分析純#65377;

1．1．3儀器設備95^－1型磁力攪拌器#65380;臺式高速冷凍離心機(日立公司)，DG21型酶聯免疫檢測儀(南京儀器廠)，pH精確測試儀(美國熱電)，Sartorious 電子天平，FD^－1冷凍干燥機#65377;

1．2抗原合成和鑒定

1．2．1免疫原[5－O－(單)琥珀酰IVM－PLL]和包被原[5－O－(單)琥珀酰IVM－OVA]的合成首先將IVM衍生化[3] ，在C5－OH引入羧基，然后分別采用NHS法和混合酸酐法實現IVA與PLL及OVA的交聯#65377;反應后的終產物在4℃條件下透析3 d，多次換液，最初2 d用0．1 mol·L^－1 PBS透析，第3天用蒸餾水透析，Sephdex _g－200純化，冷凍干燥保存#65377;

1．2．2人工抗原的鑒定采用SDS－PAGE法進行鑒定，SDS－PAGE所用濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，電泳完畢后用考馬斯亮藍R－250 2．5 _g·L^－1染色5 h，脫色液脫色至背景清晰為止#65377;凝膠成像系統軟件計算載體蛋白與半抗原的結合比[4]#65377;

1．3抗體的制備

用合成的免疫抗原5－O－(單)琥珀酰IVM－PLL免疫健康新西蘭大白兔，按常規制備血清[5]#65377;選6只2月齡#65380;體重1．5～2 kg的健康新西蘭大白兔，雌雄各半，取雌雄各1只作為陰性對照組，剩余4只為試驗組#65377;將5－O－(單)琥珀酰IVM－PLL凍干粉用生理鹽水溶解，配成1 _g·L^－1的溶液#65377;初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化后于兔子背部多點注射，每只1 mL#65377;加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化，第1次加強免疫于足下注射，以后的加強免疫于肌肉注射，每10 d加強免疫1次，劑量與初次免疫相同#65377;4次加強免疫后從耳緣靜脈采血，采用間接競爭酶聯免疫法測定抗血清效價#65377;待效價達到要求后，用耳靜脈放血與心臟放血相結合獲得抗血清，加入2 _g·L^－1疊氮鈉和500 mL·L^－1甘油，分裝，－20℃保存備用[6]#65377;

1．4抗體的鑒定

1．4．1ELISA基本條件的建立采用間接ELISA法測定抗體效價#65377;用1 mg·L^－1的溶液5－O－(單)琥珀酰IVM－OVA包被96孔酶標板，每孔100 μL，于4℃冰箱過夜#65377;充分洗滌后，用20 _g·L^－1的OVA溶液封閉酶標板，每孔200 μL，4℃冰箱過夜#65377;洗滌后，于37℃溫育箱內烘干待用#65377;上述步驟使得測定的抗體效價是針對IVM的#65377;取4條酶標板條#65377;第1行加抗體稀釋液作為空白對照；第2行加1∶1 000稀釋的陰性血清；以下6行分別為1∶400#65380;1∶800#65380;1∶1 600#65380;

1∶3 200#65380;1∶6 400和1∶12 800的陽性血清，每孔100 μL，室溫孵育30 min#65377;然后依次加入HRP標記的羊抗兔IgG和TMB顯色液，均為每孔100 μL，每一步都要經過洗滌和孵育#65377;最后用2 mol·L^－1 H2SO4終止反應，測定OD450值#65377;用方陣滴定法測定抗體及包被原的工作濃度#65377;選擇光密度值為1．0左右時的抗原濃度和抗體稀釋度作為工作濃度#65377;

1．4．2抗體敏感度的測定用間接競爭ELISA測定抗體對IVM的敏感度#65377;用含10%甲醇的PBST(0．01 mol·L^－1 PBS，pH7．4，含0．05%的Twen－20)溶液#65377;配制0#65380;0．01#65380;0．10#65380;1．00#65380;2．00#65380;10．00#65380;20．00#65380;100．00 μg·mL^－1的標準溶液，與抗體預混過夜#65377;按已優化的競爭ELISA條件操作，將含0 ng·mL^－1標準品孔的OD值減去含最大濃度標準品孔的OD值定為B0，其余孔OD值經同樣方法校正后定為B；以B/B0值為縱坐標，相應的標準品濃度log值為橫坐標，繪制標準曲線，并計算抑制中濃度(I50)及最低檢測限(I10)#65377;

1．4．3抗體特異性的測定為了檢測所得抗血清是否對IVM有較強的特異性，采用間接競爭ELISA法，在最適工作濃度的抗血清中加入倍比稀釋的IVM標準液，事先進行預孵育，然后再加至酶標板上進行反應，觀察各孔OD值的變化，基本步驟同效價測定，不同之處在于加樣，配制濃度為1 mg·mL^－1的IVM母液，進行倍比稀釋，50 μL IVM抗血清以二分之一工作濃度加等體積比稀釋的IVM標準溶液，先在37℃孵育1h，同時以50 μL的抗血清和等體積PBS混合物作為標準，以50 μL PBS與50 μLPBS混合物作空白對照，然后再加到酶標板上進行反應，每孔100 μL，37℃孵育1 h#65377;

1．4．4抗體的交叉反應性檢測在優化的間接競爭ELISA基礎上，測定與多拉菌素#65380;莫西霉素的I50值，并計算其交叉反應率#65377;交叉反應率(%)=I50(IVM)/I50(競爭物)×100

2結果與分析

2．15－O－(單)琥珀酰IVM－PLL的SDS－PAGE分析

合成的人工抗原5－O－(單)琥珀酰IVM－PLL的SDS－PAGE條帶的遷移率比載體的遷移率略小(圖1)，表明人工抗原的分子質量大于相應載體的分子質量，證明人工抗原合成成功#65377;并可以計算出結合比為25．3#65377;

2．2抗體效價的測定

間接ELISA的測定表明，用非免疫5－O－(單)琥珀酰IVM－OVA包被，以惰性蛋白OVA封閉及每一步驟均充分洗滌，便可排除非特異性吸附的可能，故測定的抗體效價是針對IVM的#65377;將獲得的4種兔血清分別作ELISA試驗，間接ELISA測定表明，若以A450≥陰性對照的2．1倍作為抗血清的效價，由此測得的抗血清效價為1∶12 800#65377;系列濃度的包被抗原包被酶標板，抗血清作7個稀釋濃度，同時在一96孔酶標板上用方陣滴定法進行確定#65377;選擇OD值在1．0左右，且抗原抗體用量最少的抗原包被物濃度和抗血清的稀釋度為最適工作濃度#65377;包被抗原濃度為0．03 _g·L^－1，抗血清最適工作稀釋度為1∶5 000#65377;

2．3抗IVM標準工作曲線

在上述優化條件下，將標準IVM溶液按間接競爭ELISA方法進行測定#65377;以標準IVM溶液濃度的對數為橫坐標，以抑制率為縱坐標，繪制出標準曲線#65377;抑制率I=(B0－B)/B(B為樣品OD值，B0為空白對照OD值)#65377;最小檢測限為0．94 ng·g^－1，線性回歸方程為y=62．30^－19．07x#65377;

選用與IVM具有相同大環內酯結構的多拉菌素和莫西霉素來做抗體的特異性分析#65377;結果表明，抗體對多拉菌素和莫西霉素的交叉反應率均小于0．1%#65377;

3討論

特異性抗體的制備是利用免疫學方法進行化學藥物殘留分析的關鍵因素，小分子物質抗體的制備往往很困難#65377;而IVM屬于小分子物質，本身無免疫原性，必須經過結構改造后與大分子載體蛋白結合方具有免疫原性#65377;筆者根據IVM的結構特點，將C5－OH進行結構改造，獲得羧基后，與載體蛋白PLL偶聯在一起，免疫動物后產生IVM的特異性抗體#65377;采用間接ELISA法測定其效價達到1∶1．28×106#65377;

Schmidt等報道了AVM單克隆抗體的制備，分別選擇C4′及C5兩個位點進行反應，用由C4′位羥基反應得到的半抗原與BSA偶聯免疫balb/c系小鼠，產生了良好的免疫應答；而用由C5位羥基反應得到的半抗原，用同樣的方法與BSA及伴白蛋白(conalbumin)連接，卻不具有免疫原性#65377;這可能是由于偶聯物的結合比不同及制備方法不同(半抗原的不同活性位點與蛋白相連)引起的[7]#65377;

本試驗選用IVM C5位上羥基作為改造位點，將其轉變為琥珀酸半酯，從而在分子中引入羧基，再用NHS法與PLL連接，合成的人工抗原經動物免疫證明具有良好的免疫原性#65377;

參考文獻：

[1]朱兆璋，李驥聯，沈寅初．天然殺蟲素阿維菌素的結構改造產物伊維菌素[J]．農藥譯叢，1995，17(6)：21－28．

[2]馬少麗，李聞，郭志宏． 阿維菌素對犬#65380;驢和騾的毒性觀察[J]．青海畜牧獸醫，2001，31(3)：22－23．

[3]EVRARD P，GASPAR P，MAGHUIN－ROGISTER _g． Aspecific radioimmunoassay for the detection of 19－nortestosterone residues in urine and plasma of cattle[J]． Journal Oflmmunoassay， 1986，7(4)：353－363．

[4]KAMPS H C， CARLIN R J， SHEFFIELD C， et al． Analysis of hapten－carrier protein conjugates by nondenaturing delelectrophoresis[J]． Journal Immunological Methods，1993，164：245－253．

[5]朱立平，陳學清．免疫學常用實驗方法[M]． 北京：人民軍醫出版社，2000．56．

[6]孫敬方．動物試驗方法學[M]．北京：人民衛生出版社，2001．232－241．

SCHMIDT D J， CLARKSON C E， SWANSON T A． Monoclonal antibodies for immunoassay of avermectins [J]． J Agric Food Chem，1990，38：1763^－1770．