規模化養殖場大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性監測

(1．湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢430209；2．華中科技大學同濟醫學院附屬醫院，武漢430030)

摘要：從武漢郊區規模化養殖場采集腹瀉仔豬的棉拭子和病死動物的泄殖腔分泌物或肝臟，分離鑒定出致病性大腸桿菌73株，分離率為100%#65377;采用K－B法對分離菌株進行體外藥物敏感試驗，根據CLSI 2006標準判定結果#65377;結果顯示，豬源性大腸桿菌僅僅對阿米卡星和大部分頭孢類抗菌藥物的耐藥率較低，對多數抗菌藥物均表現為較高的耐藥率，并呈現出嚴重的多重耐藥現象，主要表現為7重耐藥#65380;8重耐藥#65380;9重耐藥和10重耐藥；禽源性大腸桿菌對頭孢類#65380;氨基糖苷類和硝基呋喃類抗菌藥物的耐藥率<30%，其他的均>75%，多重耐藥主要表現為6重耐藥，總體看來，其耐藥性較豬源性大腸桿菌輕微#65377;

關鍵詞：豬源性大腸桿菌；禽源性大腸桿菌；致病性；耐藥性

中圖分類號：S852．61+2；S854．4+3；S859．7文獻標識碼：A文章編號：0439－8114(2008)06－0688－04

Identification and Drug Resistance Surveillance of Escherichia coli in Large Scale

DENG Jun－hua1， XIONG Zhong－liang1， WANG Hong－lin1， SUN Zi－yong2， XU Di－ping1

(1． Institute of Animal Husbandry and Vetirinary， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064， China；

2． Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030， China)

Abstract： 73 strains pathogenic Escherichia coli was obtained from diarrhea piglets and died animals on breeding farm in the suburbs of Wuhan． The rate of isolation was 100 percent． Antibiotic susceptivity was tested by Kirby－bauer method． Results were assessed according to CLSI 2006． Results： The resistance rates of swine E．coli to Amikacin and most of Cephalosporins were low， but high to other antibiotics． Multiple resistances mainly were resistance to 7，8，9 and 10 antibiotics． The resistance rates of avian E．coli to Cephalosporins， Aminoglycoside and Nitrofurans antibiotics were less than 30 percent， to other antibiotics were more than 75 percent． Multiple resistances mainly were resistance to 6 antibiotics． In _general， the resistance of avian E．coli was less than that ofswine E．coli．

Key words： swine Escherichia coli； avian Escherichia coli； pathgenicity； drug resistance

大腸桿菌病在規模化養殖場的生產上是常見的原發性或繼發性傳染病#65377;目前許多養殖場使用抗菌藥物來防治和治療大腸桿菌病，但由于使用不當，使耐藥菌株大量出現，多重耐藥更是嚴重，給養殖業造成了重大的經濟損失，也給食品安全帶來了不利影響#65377;本文收集了73株來自規模化養殖場的致病性大腸桿菌，對它們的耐藥性進行了監測和分析，并比較了不同動物來源大腸桿菌的耐藥現狀，以期為臨床用藥提供理論依據#65380;為耐藥性的發展趨勢研究提供線索#65377;

1材料與方法

1．1試驗材料

1．1．1培養基普通肉湯培養基購自北京中龍正虹藥業有限公司；麥康凱瓊脂(MacConkey Agar)#65380;三糖鐵瓊脂(Triple Sugar Irion Agar)#65380;M－H瓊脂(Mueller－Hintion Agar)培養基均購自杭州微生物試劑有限公司#65377;

1．1．2藥敏用品細菌微量生化反應管購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏質控菌株為大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922，購于中國獸醫藥品監察所；麥氏比濁管購自溫州市康泰生物科技有限公司，批號為GJ26#65377;

1．1．3試驗動物小白鼠，購自武漢市洪山區疾病控制中心#65377;

1．2病料的采集

1．2．1直腸棉拭子2007年9#65380;10月，在武漢郊區的幾個規模化養殖場，取腹瀉仔豬的直腸棉拭子，將擦取直腸表面粘液后的拭子浸入無菌生理鹽水中充分洗脫，其懸浮液置4℃保存備用#65377;

1．2．2病死動物的泄殖腔分泌物或肝臟時間#65380;地點同上，將病死動物解剖后，取泄殖腔分泌物或肝臟組織，直接接種培養基#65377;

1．3細菌的分離鑒定

取病料接種到麥康凱瓊脂平板，37℃培養24 h后，挑取粉紅色菌落接種營養肉湯進行純培養，然后取新鮮純培養物接種在三糖鐵瓊脂斜面和細菌微量生化反應管，37℃培養24～48 h后觀察結果#65377;

1．4致病性試驗

取分離鑒定的菌株，接種營養肉湯37℃#65380;18 h后，取培養物分別腹腔接種18～22 _g重的小白鼠，每只0．2 mL，觀察其發病及死亡情況，及時剖檢死亡小白鼠，取肝臟接種麥康凱瓊脂平板分離細菌#65377;

1．5藥敏試驗

采用WHO推薦的K－B法(紙片擴散法)#65377;于麥康凱瓊脂平板上取單個典型粉紅色菌落接種于營養肉湯，37℃#65380;18 h后用無菌生理鹽水將菌量稀釋到0．5麥氏比濁管，相當于1×108CFU·mL^－1#65377;15 min內用滅菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于厚4 mm的MH瓊脂平板，經室溫干燥3～5 min后，用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于瓊脂平板表面，各紙片中心相距應大于24 mm#65377;紙片距平板內緣應大于15 mm，37℃#65380;16～18 h后用直尺量取抑菌圈直徑#65377;根據CLSI 2006標準判定結果，用WHONET5．4軟件分析試驗數據#65377;

2結果與分析

2．1細菌的分離鑒定

病料接種麥康凱瓊脂平板，37℃培養24 h后，均有中等大小表面光滑濕潤的粉紅色菌落生長，染色鏡檢為中等大小的革蘭氏陰性桿菌#65377;將新鮮培養物接種三糖鐵瓊脂斜面37℃培養24 h后均表現為斜面底層變黃#65380;有氣體無變黑的現象；生化特性為：分離菌均能發酵葡萄糖#65380;乳糖#65380;麥芽糖#65380;甘露醇#65380;木糖和阿拉伯糖，葡萄糖(產氣)和MR均為陽性，少數分離菌的蔗糖為陽性，VP#65380;尿素酶和檸檬酸鹽均為陰性，判斷分離菌均為大腸桿菌[1，2]#65377;共分離出豬源性大腸桿菌45株，禽源性大腸桿菌28株，分離率為100%#65377;

2．2致病性試驗

接種分離菌培養物的小白鼠在48 h內均出現死亡，取小白鼠的肝臟接種麥康凱瓊脂平板，回收到原接種菌#65377;

2．3藥敏試驗

2．3．1抗菌藥物的敏感性試驗試驗顯示，豬源性大腸桿菌分離菌對復方新諾明和四環素的耐藥率達到100%，對卡那霉素#65380;氨芐青霉素和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率也達到了80%以上#65377;45株分離菌中耐藥率最低的為頭孢類抗菌藥物，除頭孢美唑的耐藥率達到60%外，其余的均小于15%；耐藥率較低的還有氨基糖苷類的阿米卡星，其耐藥率為15．6%(表1)#65377;禽源性大腸桿菌分離菌對青霉素類#65380;四環素類#65380;氟喹諾酮類和磺胺類抗菌藥物的耐藥率較高，均在75%以上，對頭孢類#65380;氨基糖苷類和硝基呋喃類抗菌藥物的耐藥率較低，均在30%以下(表2)#65377;

2．3．2抑菌環直徑分布分析各抗菌藥物對受試菌株的抑菌環直徑分布圖，將能更好地判斷細菌對該抗菌藥物的耐藥性發展趨勢#65377;如豬源性大腸桿菌的藥敏試驗中，具有相似耐藥率的頭孢他定和頭孢唑啉，抑菌環直徑分布有明顯的差別(圖1和圖2)，頭孢唑啉的直徑分

布比較接近耐藥的邊緣，從趨勢看，原敏感的菌株可能很快就不敏感了；而頭孢他啶的直徑分布則完全不同，敏感菌株的抑菌環直徑分布比較偏右，也就是敏感程度還較高，中敏菌株較少，高敏菌株較多，產生耐藥性的機會比頭孢唑啉少#65377;比較禽源性大腸桿菌的藥敏試驗中頭孢他啶和呋喃妥因的抑菌環直徑分布圖(圖3和圖4)，推測呋喃妥因的耐藥性發展趨勢則更明顯#65377;

2．3．3大腸桿菌多重耐藥現象嚴重73株大腸桿菌均出現了多重耐藥，受試的16種抗菌藥物，最少的為3重耐藥，最多的達到16重耐藥(見表3和表4)#65377;比較豬源性大腸桿菌和禽源性大腸桿菌的多重耐藥情況，豬源性主要表現為7耐(6/45)#65380;8耐(10/45)#65380;9耐(10/45)和10耐(9/45)，而禽源性的主要表現為6耐(12/28)#65377;

3討論

本試驗從發生腹瀉的動物和病畜實質內臟中分離的大腸桿菌具有較強的毒力，均能使小白鼠在48h內死亡，表明分離的大腸桿菌均為致病菌，與黎滿香等的研究結果一致[3]，說明規模化養殖場原發或繼發感染大腸桿菌的現象嚴重#65377;

從藥敏試驗結果中可以看出，對于本試驗中致病性的豬源性大腸桿菌，頭孢他啶#65380;頭孢噻肟#65380;頭孢哌酮#65380;頭孢唑啉和頭孢吡肟的高敏率均在80%以上，阿米卡星是除頭孢類抗菌藥物外的另一種高敏抗菌藥物，高敏率達到了82．2%(表1)，與本試驗中的禽源性大腸桿菌具有一定的相似性#65377;參考近幾年的研究報道，發現該結果與安迥鳳[4]和姜中其等[5]報道的豬源大腸桿菌#65380;韓偉等[6]報道的禽源大腸桿菌和李濤等[7]報道的人源大腸桿菌的藥敏試驗結果均具有一定的相似性，由此說明大多數頭孢類抗菌藥物及阿米卡星對不同來源大腸桿菌的敏感率均較高，在臨床感染上具有較好的治療效果，何學謙等[8]和劉明春等[9]的臨床資料證明了這一點#65377;

比較兩種不同來源的大腸桿菌的藥敏試驗結果(表1和表2)，對頭孢類抗菌藥物的耐藥率相似，對青霉素類和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率是禽源性的大于豬源性的，其他的則相反；從多重耐藥情況來看(表3和表4)，最少的為3重耐藥，最嚴重的為16重耐藥，與黎滿香等[3]和劉夢元等[10]的研究結果一致，說明在規模化養殖場中大腸桿菌的耐藥性問題已經十分嚴重，在臨床上必須引起高度重視#65377;豬源性的多表現為7耐#65380;8耐#65380;9耐和10耐，而禽源性的主要表現為6耐，由此說明豬源性的耐藥情況較禽源性的嚴重，推測主要是因為豬病的復雜性增加了抗菌藥物在臨床上的預防和治療用量，導致豬源性細菌產生嚴重的耐藥性#65377;

參考文獻：

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