蛋白ＡＧ檢測多種動物弓形蟲抗體ＡＧ－ＥＬＩＳＡ的效果評價

(1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)a．農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室；b．動物醫(yī)學(xué)院，武漢430070；

2．河南省南陽市動物疫病控制中心，河南 南陽473010)

摘要：利用建立的可檢測多種動物弓形蟲抗體的AG－ELISA方法，檢測了人工感染及自然感染4種動物血清中的弓形蟲抗體#65377;對人工感染豬血清的檢測結(jié)果表明，AG－ELISA法可于感染后第10天全部檢出陽性，早于MAT方法的第14天，其檢出率#65380;敏感性及準確度等指標亦優(yōu)于MAT法#65377;在對臨床上304份動物血清檢測中，AG－ELISA法對豬#65380;羊血清的陽性檢出率高于MAT法，而對犬#65380;貓血清的檢出率則與MAT法相同#65377;Kappa一致性試驗表明，AG－ELISA法與MAT法符合良好#65377;上述結(jié)果證實AG－ELISA法可用于多種動物弓形蟲抗體的檢測#65377;

關(guān)鍵詞：弓形蟲；重組MIC3；AG－ELISA

中圖分類號：S852．72+3；S854．4+3文獻標識碼：A文章編號：0439－8114(2008)06－0692－04

Evaluation of AG－ELISA for the Detection of Anti－Toxoplasma _gondii Antibodies in Sera from Many Species of Animals

ZHANG Dong－lin1a，1b，HUI Yu1a，2，ZHOU Yan－qin1b，WANG Yu－h(huán)ai2，F(xiàn)ANG Rui1a，1b，NIE Hao1a，1b，

WANG Zheng－song1a，1b，ZHAO Jun－long1a，1b

(1a． State key Laboratory of Agromicrobiology； 1b． College of Veterinary Medicine， 1．Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China； 2． Department of Veterinary Control of Nanyang City， Nanyang 473010， Henan， China)

Abstract：AG－ELISA was developed and used to detect anti－ Toxoplasma _gondii Ab in experimentally infected pigs and clinical samples of pigs， _goats， dogs and cats in the study． In experimentally infected pigs， AG－ELISA was able to detect all animals as positive at day 10 at a mean ratio of 3．10，while MAT at day 14 at a mean titer of 1∶40． AG－ELISA showed higher prevalence(77．3%)，sensitivity (94．4%)，negative predictive value(80%) and accuracy(95．4%) than MAT． Kappa results were estimated and a _good agreement was observed in AG－ELISA×MAT (K=0．85，P<0．001) using commercial ELISA kit as _gold standard． A total of 304 clinical samples were detected by AG－ELISA and MAT methods， the results showed a higher prevalence in pig and _goat sera than MAT， and the same prevalence in dog and cat sera． All these results indicated that AG－ELISA could be a _good method for serological detection of T． _gondii infection in many species of animals．

Key words： Toxoplasma _gondii； MIC3； AG－ELISA

弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasma _gondii)引起的危害嚴重的人獸共患原蟲病，可感染人和多種脊椎動物，對畜牧業(yè)生產(chǎn)及公共衛(wèi)生均造成重大危害#65377;由于本病多呈亞臨床感染，易造成漏診而貽誤治療時機#65377;因此，建立準確快速的實驗室診斷方法是控制弓形蟲病的重要措施之一，其中血清學(xué)檢測方法已被公認為重要的輔助診斷手段#65377;目前國內(nèi)應(yīng)用較多的是IHAT及ELISA方法[1－3]#65377;IHAT法適用于各種動物，快速簡便，但敏感性及特異性較低，實際應(yīng)用效果受到影響#65377;ELISA法敏感特異，快速簡便，但一種ELISA方法往往只能檢測一種特定動物血清中的抗體，并且以蟲體成分作為抗原時可能存在非特異性反應(yīng)的現(xiàn)象[4]#65377;葡萄球菌A蛋白(staphylococcal proteinA SPA)及鏈球菌G蛋白(streptalococcal protein _g SPG)是一類能與血清IgG抗體不變區(qū)牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)[5，6]#65377;SPA可結(jié)合人#65380;豬#65380;兔等動物的IgG，但不結(jié)合胎牛及羊血清中的IgG#65377;而SPG則與牛#65380;羊等反芻動物血清IgG有較強的結(jié)合能力，且與IgM無交叉反應(yīng)#65377;采用現(xiàn)代基因合成技術(shù)，結(jié)合二者的優(yōu)點而合成的融合蛋白AG擴大了其應(yīng)用范圍，并成功地應(yīng)用于野生動物病毒性感染的血清學(xué)檢測[7，8]#65377;基于以上原因，我們以本實驗室高效表達的重組弓形蟲MIC3代替?zhèn)鹘y(tǒng)的蟲體或蟲體成分作為診斷抗原[9]，采用重組蛋白AG代替第二抗體，以期建立一種靈敏特異#65380;適用于多種動物血清弓形蟲抗體檢測的Ab－ELISA方法#65377;在確立最適反應(yīng)條件后，以之檢測臨床動物血清，并與ELISA試劑盒及MAT等方法進行比較，以評價其臨床應(yīng)用效果#65377;

1材料與方法

1．1材料及試劑

辣根過氧化物酶標記的蛋白AG(HRP－AG)購自Pierce公司，3，3’，5，5’－四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及卵清蛋白(OVA)購自Sigma公司，可拆卸酶標板購自加拿大Jet公司，其他試劑均為AR級#65377;

1．2試驗動物

華貿(mào)×長大雜優(yōu)商品豬，體重15～20 kg，性別不限，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗豬場提供，經(jīng)AG－ELISA及PCR檢測均為弓形蟲陰性；昆明系小鼠(清潔級)，雌雄不限，體重20 _g±2 _g，購自湖北省實驗動物研究中心#65377;

1．3人工感染豬血清的制備

試驗豬12頭，試驗前1周經(jīng)AG－ELISA及MAT方法檢測弓形蟲抗體陰性#65377;隨機分為2組，A組8頭，皮下注射活化的Toxoplasma _gondii速殖子，每頭豬50 000個；B組4頭，為空白對照，皮下注射生理鹽水#65377;分別于感染后0#65380;7#65380;10#65380;14#65380;21#65380;28#65380;35#65380;42#65380;49#65380;57 d采血，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆?65377;

1．4臨床動物血清的來源

臨床動物血清(豬血清197份，山羊血清60份，犬血清23份，貓血清14份)由本院獸醫(yī)院及相關(guān)寵物醫(yī)院收集保存，豬弓形蟲病陽性及陰性血清由本室制備保存#65377;

1．5重組抗原的獲得

利用本室構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒pGEX－KG－MIC3轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)BL21－ CodonPlus中，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，溶菌酶處理，超聲裂解后加入DOC處理10 min#65377;所得包涵體經(jīng)變性#65380;復(fù)性#65380;透析#65380;濃縮后進行SDS－PAGE及Western blot分析，用蛋白檢測儀檢測濃度后用作AG－ELESA反應(yīng)的包被抗原#65377;

1．6SPA－ELISA檢測方法的建立

AG－ELISA最佳反應(yīng)條件的選擇上，采用方陣試驗確定抗原及血清稀釋倍數(shù)，在此基礎(chǔ)上確定HRP－AG工作濃度#65380;反應(yīng)時間等，以確定AG－ELISA的最佳反應(yīng)條件#65377;AG－ELISA的操作步驟為：將1．2所得到的重組MIC3(10．37 mg·mL^－1)用0．025 mol碳酸鹽緩沖液(pH9．6)稀釋至最佳包被濃度，加入96孔酶標板中，每孔100 μL，置4℃過夜(16 h)#65377;次日取出，甩干，加入洗滌液(PBST)，每孔150 μL，輕輕振蕩后靜置3 min，甩干，如此反復(fù)3次，最后一次甩干后在濾紙上拍干#65377;然后每孔加入150 mL封閉液(1%OVA－PBST)，置37℃作用1 h#65377;如上洗滌后加入1∶160稀釋的待檢血清，每板均加陽性及陰性血清作為對照，置37℃，45 min#65377;取出，如上洗滌后加入1∶3 000的HRP－AG(以0．1%的 OVA－PBST稀釋)每孔100 μL，37℃作用30 min#65377;取出后如上洗滌4次，每孔加入TMB底物液100μL，室溫避光靜置10 min#65377;加入50 μL 0．25%的HF終止反應(yīng)，用酶標儀測定OD630值，記錄結(jié)果#65377;當待檢血清OD630值/陰性對照OD630值(S/N)≥2．3時，則判定為弓形蟲抗體陽性，否則判為陰性#65377;

1．7ELISA kit及MAT方法

ELISA試劑盒(ELISA kit)購自加拿大Safepath Laboratory，按說明書進行操作#65377;用以檢測人工感染豬血清中的弓形蟲抗體水平，并與AG－ELISA比較#65377;MAT方法參考文獻[10]的方法進行#65377;用于檢測豬#65380;山羊#65380;犬及貓血清中的弓形蟲抗體水平，并與AG－ELISA比較#65377;

1．8結(jié)果處理

參考Greiner和Gardner的方法[11]，對3種方法檢測得到的檢出率#65380;敏感性#65380;準確度等結(jié)果及不同方法之間的符合率進行統(tǒng)計學(xué)處理#65377;

2結(jié)果與分析

2．1人工感染豬血清中弓形蟲抗體的檢測結(jié)果

分別應(yīng)用AG－ELISA#65380;ELISAK以及MAT 3種方法對人工感染所采集的全部88份血清進行平行測定，結(jié)果見表1#65377;AG－ELISA在攻蟲后第7天可檢出陽性血清(4/8)，攻蟲后第10天全部檢出陽性，整個試驗過程共檢出陽性血清68份；MAT則于攻蟲后第7天檢出陽性血清(2/8)，攻蟲后第14天全部檢出陽性，共檢出陽性血清63份；AG－ELISA及MAT所檢出的抗體產(chǎn)生高峰均出現(xiàn)于攻蟲后第35天；在試驗結(jié)束(攻蟲后57 d)時，2種方法所檢出的抗體水平均維持在較高水平#65377;以ELISA kit所得結(jié)果為標準參照，對AG－ELISA及MAT的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理#65377;結(jié)果表明，AG－ELISA在檢出率#65380;特異性及準確度等方面均優(yōu)于MAT法(表2)#65377;3種方法相互之間的Kappa一致檢驗結(jié)果見表3，從表3可見，AG－ELISA與MAT之間符合良好(K=0．86，P<0．001)；AG－ELISA與ELSA kit所得結(jié)果亦符合良好(K=0．83，P<0．001)；MAT與ELISAS kit之間符合較好(K=0．74，P<0．001)#65377;

2．2對臨床4種動物血清的抗體檢測結(jié)果

運用AG－ELISA以及MAT方法對304份臨床血清進行平行測定，結(jié)果見表4#65377;表4顯示，AG－ELISA對豬及山羊血清的陽性檢出率高于MAT方法；在犬及貓血清的陽性檢出率上，二者所得結(jié)果相同#65377;對兩種方法所得結(jié)果進行一致性檢驗，結(jié)果表明，二者符合良好(K=0．85，P<0．001)#65377;

3討論

與其他血清學(xué)方法相比較，ELISA法具有易實現(xiàn)自動化操作#65380;結(jié)果測定客觀性強#65380;對操作者無特殊要求及可在短時間內(nèi)處理大量樣品的優(yōu)點#65377;但傳統(tǒng)的ELISA法檢測特定動物時，要求使用相應(yīng)種屬的特異性第二抗體，這就限制了該方法在多種動物共患的傳染性疾病檢測中的廣泛應(yīng)用#65377;而利用蛋白AG，結(jié)合多種動物IgG的Fc片段的特性所發(fā)展起來的AG－ELISA法，可克服傳統(tǒng)ELISA法的這一局限，曾成功地運用于多種野生動物病毒性感染的血清學(xué)診斷[7，11]#65377;本研究首次將這一方法應(yīng)用于弓形蟲病的血清學(xué)診斷，并以之分別檢測了豬#65380;山羊#65380;犬及貓等動物的人工感染及自然感染血清中的弓形蟲抗體#65377;試驗結(jié)果表明，AG－ELISA法在檢出率#65380;敏感性及準確度等方面優(yōu)于MAT法，在人工感染及臨床動物血清抗體檢測中，2種方法符合良好#65377;

在血清學(xué)方法應(yīng)用效果的評價上，以使用自然感染或臨床血清者居多#65377;Lind等在比較了人工感染及自然感染弓形蟲血清的檢測結(jié)果后認為，應(yīng)用人工感染血清，由于感染時間及采血時間可人為控制，所得血清抗體水平高且一致，因此具有較高評判價值[12]#65377;本研究應(yīng)用國際標準化強毒株，采用皮下注射方法人工感染健康仔豬，定期采血并分離血清，之后以3種血清學(xué)方法進行平行測定，結(jié)果顯示3種方法分別在攻蟲后7～14天內(nèi)檢出全部抗體，抗體產(chǎn)生高峰均出現(xiàn)于攻蟲后28～35 d，且整個試驗周期的弓形蟲血清抗體均維持在較高水平，與國外文獻的報道相一致[13]#65377;結(jié)合同時進行的臨床血清抗體檢測結(jié)果，有力地證明了AG－ELISA方法可準確地檢測出動物血清中的弓形蟲抗體#65377;

利用AG－ELISA法檢測多種動物血清時，結(jié)果判定標準的制定也可影響到反應(yīng)的特異性及敏感度#65377;本文通過比較4種動物血清的OD值，確定以S/N≥2．3為陽性判定標準，在臨床血清檢測中獲得了較好的檢出率及符合率，同時方便檢測者實際操作，可以在同一塊酶標板上檢測多種動物血清#65377;

綜上所述，本文所建立的AG－ELISA方法可高效特異地檢測出多種動物血清中的弓形蟲抗體，適用于弓形蟲病這一宿主范圍廣泛的人獸共患寄生蟲病的抗體檢測，對該病的診斷#65380;檢疫及流行病學(xué)調(diào)查具有較高的實用價值#65377;

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