柱層析法在分離純化番茄紅素中的應(yīng)用

(河南科技學(xué)院a．生命科技學(xué)院；b．食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003)

摘要：采用柱層析法分離純化番茄紅素#65377;結(jié)果表明，最佳分離條件為吸附劑100～200目層析硅膠；常溫下吸附，洗脫；番茄紅素油樹脂與丙酮的比例為1∶10；洗脫劑為丙酮；洗脫流速為3．5mL·min^－1；高效液相色譜分析表明，柱層析后樣液色譜圖基本上與番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖一致，能達(dá)到分離純化的目的#65377;

關(guān)鍵詞：番茄紅素；柱層析；分離純化

中圖分類號(hào)：S641．2；TS255．5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：0439－8114(2008)06－0701－03

Application of Column Chromatogram on Separation and Purification of Lycopene

HAN Zhan－jianga，WANG Wei－h(huán)uab

(Henan Institute of Science and Technology a． College of Life Science and Lechnology；b．Food College，Xinxiang 453003，Henan，China)

Abstract： Separation and purification of lycopene by column chromatogram were studied． The results indicated that the optimum conditions of column chromatogram that absorbent： 100～200 silica _gel， adsorption and desorption at normal temperature，ratio of Lycopene oleoresin and acetone=1∶10， desorption solvent：Acetone ，the flow rate on adsorption：3．5mL·min^－1． The analytic result of HPLC indicated that the HPLC chart of the solution after chromatogram and the standard lycopene solution were resemblant． It expressed that column chromatogram could separate and purify lycopene．

Key words： lycopene；column chromatogram；separation and purification

番茄紅素是一種脂溶性天然色素，1903年Schunck發(fā)現(xiàn)番茄中的紅色素的吸收光譜與胡蘿卜素不同，將這種紅色素命名為番茄紅素(Lycopene)#65377;1910年Willstaller和Escher在對(duì)番茄紅素的研究中指出，番茄紅素是胡蘿卜素的異構(gòu)體，并首次確定了其分子式為C40H56，分子量為536．85#65377;番茄紅素為番茄及其產(chǎn)品提供了鮮亮的紅色，同時(shí)，具有抗氧化作用，能抗癌抑癌[1－7]#65377;近年來(lái)，在世界番茄紅素開發(fā)熱潮中，我國(guó)科技界也開始重視和加強(qiáng)番茄紅素的研究開發(fā)工作，并取得了一定進(jìn)展[6，7]#65377;但總體來(lái)說(shuō)，我國(guó)番茄紅素的生產(chǎn)和研究尚處于起步階段，與國(guó)外相比差距還很大，至今國(guó)內(nèi)市場(chǎng)番茄紅素的生產(chǎn)和應(yīng)用尚屬空白，沒(méi)有真正意義上的番茄紅素產(chǎn)品#65377;本文根據(jù)番茄紅素的結(jié)構(gòu)及特性，探索柱層析法分離純化番茄紅素的工藝條件，建立番茄紅素提取制備的新方法#65377;

1材料與方法

1．1材料

番茄為DN03068品系成熟果實(shí)#65377;番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)樣品(Sigma)，乙腈(色譜純)，二氯甲烷(色譜純)，甲醇(色譜純)，正己烷，乙酸，丙酮，石油醚，葡萄糖，無(wú)水氯化鋁，三氯甲烷，無(wú)水碳酸鈉，氯化鈉，氯化鋁，柱層析硅膠，去離子水(自制)#65377;以上無(wú)特殊注明的均為分析純#65377;天平，Spectrumlab 22Pc分光光度計(jì)，DS^－1高速組織搗碎機(jī)，pHS－25型酸度計(jì)，HL－2S恒流泵，BS^－100A自動(dòng)部分收集器，101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，F(xiàn)W100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，全溫振蕩培養(yǎng)箱，玻璃儀器氣流烘干器，恒溫電熱水浴鍋，高效液相色譜儀等#65377;

1．2方法

1．2．1柱層析吸附劑的選擇稱取等質(zhì)量的吸附劑(本試驗(yàn)選用硅膠#65380;氧化鋁#65380;硅藻土和活性碳作為吸附劑)，分別裝入柱中，倒入同體積同濃度的粗提液，待液體流到柱出口處，關(guān)閉活塞，使粗提液和吸附劑充分接觸#65377;15 min后，打開活塞用三角瓶接出流出液，測(cè)其吸光度值#65377;

1．2．2靜態(tài)試驗(yàn)吸附溫度選擇稱取一定量的層析硅膠，平均分成3份，置于三角瓶中，分別加入同體積同濃度(以吸光度表示，下同)的色素溶液，分別在25℃#65380;35℃和45℃恒溫振蕩24 h，于472 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液的吸光度值，計(jì)算靜態(tài)吸附率，選擇適宜的吸附溫度#65377;

1．2．3加樣濃度的確定稱取10 _g硅膠吸附劑裝柱，用丙酮潤(rùn)濕，加入不同濃度的樣品提取液，于472 nm波長(zhǎng)下測(cè)定流出液的吸光度值，以樣品液的吸光度值對(duì)單位質(zhì)量吸附劑的吸附量作圖，選取適宜的加樣濃度#65377;吸附量=■×V

1．2．4靜態(tài)試驗(yàn)洗脫劑選擇稱取一定量的層析硅膠，平均分成6份，置于三角瓶中#65377;分別加入同體積同濃度的色素溶液，25℃恒溫振蕩至吸附飽和，倒去上清液，再分別加入丙酮#65380;氯仿#65380;乙醚#65380;正己烷#65380;甲醇#65380;石油醚各20 mL洗脫番茄紅素，25℃恒溫振蕩至洗脫達(dá)到飽和，472 nm波長(zhǎng)下測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算洗脫率(%)，選擇適宜的洗脫劑#65377;

1．2．5靜態(tài)試驗(yàn)洗脫溫度選擇稱取一定量的層析硅膠，平均分成3份，置于三角瓶中，分別加入同體積#65380;同濃度的番茄紅素溶液，25℃恒溫振蕩至吸附飽和，倒去上清液，再各加入同體積的丙酮溶液洗脫色素，分別在25℃#65380;35℃和45℃條件下振蕩洗脫#65377;472 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液的吸光度值，計(jì)算洗脫率，選擇適宜的洗脫溫度#65377;

1．2．6流速的選擇稱取5 _g硅膠放入柱內(nèi)，用丙酮潤(rùn)濕，注入1 mL番茄紅素提取液，調(diào)節(jié)恒流泵轉(zhuǎn)速，待液體全部流出，再用丙酮將吸附的色素洗脫，472 nm波長(zhǎng)下測(cè)定洗脫液的吸光度值#65377;

1．2．7高效液相色譜法(HPLC)的定性分析色譜條件：色譜柱為Waters－C^－18柱，4．6×250 mm；流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶二氯甲烷=45∶10∶45；載液流速為0．6mL·min^－1；檢測(cè)器為紫外可見檢測(cè)器；波長(zhǎng)為472 nm#65377;在上述色譜條件下，注樣濃度為0．5 mg·mL^－1，進(jìn)樣量為1 μL，在高效液相色譜儀上作出標(biāo)準(zhǔn)溶

液和樣品的色譜圖并進(jìn)行比較#65377;

2結(jié)果與分析

2．1柱層析吸附劑的選擇

常用的吸附劑是硅膠#65380;氧化鋁和聚酰胺#65377;本試驗(yàn)選用了硅膠#65380;氧化鋁#65380;硅藻土作為吸附劑，進(jìn)行比較試驗(yàn)(表1)#65377;由表1可知，100～200目層析硅膠和氧化鋁吸附效果較好#65377;但由于市售的氧化鋁吸附劑一般是用工業(yè)氫氧化鋁燒灼而成，所以帶有堿性，在裝柱之前必須進(jìn)行預(yù)處理，通常是加入蒸餾水，攪拌下煮沸，傾去上層清液，濾干#65380;活化，工序較繁，且價(jià)格與層析硅膠相差不多#65377;所以，常選用硅膠作吸附劑#65377;本試驗(yàn)選用100～200目層析硅膠作吸附劑#65377;

2．2溫度對(duì)柱層析硅膠吸附性能的影響

由表2可知，溫度對(duì)柱層析硅膠性能影響不顯著#65377;在低溫下色素的吸附量較高，溫度增加反而不利于吸附#65377;因此，在生產(chǎn)上可選擇常溫下吸附#65377;

2．3加樣濃度的選取

由圖1可知，等質(zhì)量吸附劑，樣品濃度越高，吸附量越大，所以加樣時(shí)應(yīng)先將粗提液濃縮#65377;但不能使樣品過(guò)濃，如果濃度過(guò)高，被分離的組分不易隨流動(dòng)相流動(dòng)，不能很好的通過(guò)整個(gè)吸附柱，分離效果會(huì)受到影響#65377;經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，綜合考慮，當(dāng)番茄紅素油樹脂與丙酮比例為1∶10時(shí)效果最佳#65377;

2．4洗脫劑的選取

各種洗脫劑對(duì)色素的洗脫效果比較見表3#65377;從表3可知，氯仿的吸附效果最好，其次是丙酮，但氯仿的毒性較大，所以選擇丙酮作為洗脫劑#65377;

2．5溫度對(duì)柱層析硅膠洗脫性能的影響

結(jié)果表明(表4)，常溫下洗脫的效果比較好，控制較容易，溫度升高洗脫效果反而不好，常溫下洗脫更適合于生產(chǎn)，因此，生產(chǎn)中可選擇常溫洗脫#65377;

2．6流速的選擇

粗提液在層析柱中的停留時(shí)間太短，吸附不能達(dá)到平衡#65377;由表5可知，流速越大，吸附效果越好，理論上講，較大的流速可以改善傳質(zhì)效果，本試驗(yàn)使用的層析柱內(nèi)徑和高度都很小，粗提液流速不會(huì)太大，而且在常壓下，測(cè)量的流速都是平均流速#65377;由本試驗(yàn)得出流速為3．5mL·min^－1時(shí)吸附效果最好#65377;

2．7高效液相色譜(HPLC)法的定性分析

由圖2#65380;圖3可知，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間為3．597 min，被檢樣品的保留時(shí)間為3．598 min#65377;表明柱層析后樣液的色譜圖基本上與標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖一致，可見柱層析能達(dá)到分離#65380;純化的目的#65377;

3小結(jié)

本研究確定番茄紅素分離#65380;純化的條件：柱層析的吸附劑為100～200目層析硅膠；常溫下吸附，洗脫；番茄紅素油樹脂與丙酮的比例為1∶10；洗脫劑為丙酮；洗脫流速為3．5mL·min^－1#65377;

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