超聲波提取柑橘果皮總黃酮優化工藝

(湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所/國家食用菌加工技術研發分中心，武漢430064)

摘要：以鄂柑1號為材料，采用Plackett－Burman(PB)和中心組合設計(Central Composite Design)對影響超聲波輔助提取柑橘果皮總黃酮工藝操作的8個因素進行了篩選優化#65377;PB試驗設計與統計學分析表明，提取溫度#65380;溶劑濃度和液料比是影響總黃酮得率的3個關鍵因素，并確定其他5個因素水平為超聲波功率100W，超聲波處理時間20 min， 提取次數2次，溶劑類型為乙醇，分級水平60目#65377;對3個關鍵因素進行中心組合設計，并經響應面法優化分析得到影響總黃酮得率的二階模型#65377;結果表明，鄂柑1號果皮總黃酮得率大于6．2%的提取條件為提取溫度54．8～58℃，溶劑體積分數40%～44．6%，液料比10～12．55 mL∶1g，并進行了驗證#65377;

關鍵詞：鄂柑1號；總黃酮；Plackett－Burman設計；中心組合設計；超聲波；提取條件

中圖分類號：S666；TS255．1文獻標識碼： B文章編號：0439－8114(2008)06－0704－05

Optimization of Extraction Technique of Flavonoids from Citrus Peel with Assistance of Ultrasonic

SHI De－fang，GAO Hong，CHENG Wei，HE Jian－jun，CHEN Yu－xia

(Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear－agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences /National R D Subcenter for Edible Fungi Processing，Wuhan 430064， China)

Abstract： Using Egan No． 1 as material， Plackett－Burman (PB) design and Central Composite Design (CCD) were applied to screen and optimize influential factors for extraction process of total flavonoids from Egan No． 1 peel with assistance of ultrasonic． The extraction temperature， the ethanol concentrarion， the ratio of solvent to material， as three key factors， were found to significantly influence the yields of total flavonoids via PB design and the following statistic analysis， Other factors were as follows： ultrasonic power 100W， the extraction time 20min， extraction times 2， the kind of solvent ethanol， meshes 60．The quadratic model for three significant factors was established with the yields of total flavonoids as the target response by CCD design and response surface analysis． The optimum extraction conditions in which the yields were more than 6．2% were： temperature 54．8～58℃， ethanol concentration 40%～44．6%， and ratio of solvent to material 10～12．55 mL：1g， It was also verified experimentally．

Key words： Egan No．1； flavonoids； plackett－burman design； central composite design； ultrasonic，extracting

柑橘果皮含有豐富的總黃酮，不僅具有降血壓#65380;降血脂#65380;擴張冠狀動脈等作用，還具有抗氧化#65380;鎮咳#65380;平喘#65380;抗菌抗炎#65380;增強免疫和抗腫瘤等藥理活性[1]，作為保健品和藥品具有廣泛的應用前景[2，3]#65377;2007年全國柑橘種植面積達181．5萬hm2，產量突破1 800萬t，達到歷史新高#65377;當前及今后急需開發新型有效的提取工藝來滿足我國柑橘精深加工發展的需求#65377;鄂柑1號，又名金水柑，具湖北特色的優良品種，果色橙紅光亮，汁多化渣，濃甜爽口，風味醇香，可溶性固形物含量12．4%～13．89%，維生素C含量為34．26～38．27 mg·100g^－1，但對其深加工的研究還很少報道#65377;Plackett－Burman法在篩選試驗重要因子方面最為有效和準確[4]，可大大減少優化過程考察的因素數和試驗次數，節省大量人力#65380;和時間#65377;中心組合設計(CCD)用于確定試驗因素及其交互作用在工藝過程中對指標響應值的影響，精確地表述因素和響應值之間的關系[5]#65377;本研究采用響應面法對超聲波輔助提取鄂柑1號果皮總黃酮工藝進行優化，首先采用Plackett－Burman設計，篩選出對提取工藝起顯著作用的影響因素，再利用CCD響應面分析確定最佳提取條件，通過繪制等高線圖可直觀地反映出影響因素之間交互作用的顯著程度#65377;

1材料與方法

1．1材料

鄂柑1號果皮(湖北省農業科學院果樹茶葉研究所)，數控超聲波清洗器(KQ^－100DB型，昆山市超聲儀器有限公司)，數顯恒溫三用水浴鍋(金壇國瑞實驗儀器廠)，紫外可見分光光度計(UV2600型，上海天美科學儀器有限公司)，旋轉蒸發儀(RE－52型，上海亞榮生化儀器)，循環水式真空泵(SHZ－Ш開封宏興科教儀器廠)，植物粉碎機(LG－500A型，瑞安百信藥機械廠)，離心機(TDL－型，上海安亭科學儀器廠)，蘆丁(上海生化制品廠)，其他試劑為AR級#65377;

1．2方法

1．2．1鄂柑1號果皮總黃酮的提取工藝流程鄂柑1號果皮→干燥(60℃，5 h)→粉碎→過篩分級(60#65380;80目)→乙醇溶液振蕩浸泡→超聲波輔助回流提取→過濾→旋轉蒸發濃縮→定容→定量分析；總黃酮得率的測定采用亞硝酸鈉－硝酸鋁比色法[6]

1．2．2試驗設計[7，8]Plackett－Burman設計應用Design Expert軟件對提取試驗進行Plackett－Burman設計(因素水平設計見表1)#65377;對8個主要因素進行篩選：即提取時間#65380;液料比#65380;超聲波功率#65380;原料粒度的分級水平#65380;提取次數#65380;溶劑分數#65380;溶劑類型#65380;提取溫度，外加3個虛擬變量#65377;每個變量分別確定(+)和(－)兩個水平，以總黃酮得率為響應值，共進行12次試驗以確定每個因素的影響因子#65377;

1．2．3響應面試驗設計在確定了對響應值具有重要影響的因子后，采用中心組合設計(CCD)，對關鍵因子(提取溫度#65380;溶劑分數#65380;液料比)進行進一步研究，每個因素取5個水平，根據相應的試驗表進行試驗后，對數據進行二次回歸擬合，得到帶交互項和平方項的二次方程：

=β0+βixi+βijxixj+βijx2i

其中是預測響應值，xi是自變量，β0#65380;βi#65380;βii#65380;βij是待估計參數偏移值#65377;分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定水平范圍內求出最佳值#65377;諸因子水平及編碼見表2#65377;

2結果與分析

2．1超聲波提取工藝中影響因素的確定

提取工藝所涉及的原料粉碎度#65380;所用溶劑以及溶劑分數#65380;用量#65380;輔助提取方式#65380;提取溫度及提取時間等因素都對提取效果有影響#65377;運用Plackett－Burman對諸因素進行分析，依據實際情況選取合適的因素水平，試驗設計見表3，方差分析結果見表4#65377;

由表4可以看出，模型P為0．039 7<0．05，表明模型顯著，在被研究的整個回歸區域擬合很好#65377;由該方程的方差分析和復相關系數R=0．965 4，說明相關性較好，其中提取溫度(x8)#65380;溶劑分數(x6)#65380;液料比(x2)是有意義的模型參數(P均小于0．05)，采用響應面分析法作進一步的研究#65377;據表4回歸分析可知其他5個因素：提取時間#65380;提取次數#65380;分級水平取低水平，溶劑類型為乙醇，而超聲波功率取高水平，有利于總黃酮得率提高#65377;提取的時間和次數的減少表明原料處于一定超聲波功率作用下，有效成分提取得率趨向極限值，隨著提取時間增長以及提取次數增加，使得提取物中的雜質增多，有效成分含量反而降低；丙酮作為提取劑效果不錯，但成本和毒性較高[9]，乙醇浸提的選擇性強，浸出率高，安全性好[10]；粒度分布越小與溶劑等接觸面積大，有利于有效成分的梯度溶解；但是不能太細，否則影響過濾，造成生產效率低下和較大損耗，本文選用60目水平即可；因而確定其他5個因素水平依次為：超聲波功率100W，超聲波處理時間20 min，提取次數2次，溶劑類型為乙醇，分級水平60目#65377;

2．2CCD優化設計與響應面分析

中心組合設計及結果見表5#65377;試驗數據使用軟件進行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程：

=5．05+0．18A－0．3B－0．2C－0．085A2+0．02B2+0．068C2^－1．20AB+0．41AC+0．36BC

其中y#65380;A#65380;B#65380;C分別代表總黃酮得率#65380;提取溫度#65380;溶劑分數#65380;液料比#65377;響應面分析中對試驗結果進行擬和的二次模型方差分析見表6#65377;F值為4．93，多元相關系數為R=0．816，說明模型對實際情況擬合較好；P為0．010 1，表明該模型高度顯著，可用來進行響應值預測#65377;二次模型中回歸系數的顯著性檢驗表明，溶劑分數對提取得率的線性效應顯著，而提取溫度和液料比不顯著；3因素對提取得率的曲面效應不顯著；提取溫度和溶劑分數對提取得率的交互影響顯著，而提取溫度和液料比和溶劑分數和液料比的交互影響不顯著#65377;圖1#65380;圖2和圖3是由多元回歸方程式所做的響應曲面圖及其等高線圖#65377;由此可對兩因素交互影響提取的總黃酮得率進行分析#65377;

圖1顯示了液料比在最佳值(10．35 mL∶1g)條件下，提取溫度和溶劑分數對總黃酮得率的交互影響#65377;當溶劑分數處于低水平條件時(40%)，隨著溫度的升高，總黃酮得率出現上升趨勢，而在溶劑分數處于高水平條件下(80%)，隨著溫度的升高，總黃酮得率反而出現降低#65377;這說明溶劑分數與提取溫度之間存在顯著的交互影響，不同比例的溶劑分數與提取溫度組合，將出現不同的響應值變化趨勢#65377;應綜合考慮試劑成本和能耗的要求來確定合理的提取溫度和液料比，才能獲得較高的總黃酮得率#65377;

圖2顯示了溶劑分數處于最佳值(40．4%)時，提取溫度和液料比對提取效果的交互影響#65377;從三維圖中可以看出，兩個因素的交互影響并不顯著#65377;當提取溫度處于高水平時，可以獲得較高的總黃酮得率，且隨著液料比的增大，總黃酮得率略有增加，但不明顯，因此確定提取溫度應為較高水平#65377;

圖3顯示了提取溫度為最佳值(58℃)時，液料比和溶劑分數對提取效果的交互影響#65377;從圖中看出，在試驗水平范圍內，溶劑分數處于低水平時可獲得較高的總黃酮得率，而此時隨液料比的增加，總黃酮得率略有下降，因此料液比應為較低水平#65377;

2．3模型對提取工藝參數的優化

通過回歸模型來預測總黃酮得率高于6．3%的提取工藝參數為：提取溫度54．8～58．9℃，溶劑分數40%～44．6%，液料比10～12．55 mL∶1g，優化出5組鄂柑果皮總黃酮提取工藝參數，并進行了驗證(表7)#65377;

優化工藝中最佳實測值6．37%，與文獻中報道超聲波輔助提取的總黃酮得率5．56%相比提高了14．57%[11]#65377;表明了PB和CCD方法共同優化天然功能性成分提取工藝的可行性，優化后的工藝參數更有利于總黃酮物質的提取#65377;

2．4超聲波輔助提取工藝對總黃酮得率的影響

提取次數#65380;溶劑類型#65380;分級水平相同的條件下，本試驗確定的超聲波輔助提取工藝(超聲波功率100W，超聲波處理時間20 min，提取溫度58℃，溶劑分數40．4%，液料比10．35 mL∶1g)，與回流法優化的提取工藝(提取時間90 min#65380;提取溫度65℃#65380;溶劑分數70%#65380;液料比15 mL∶1g)所得總黃酮得率進行比較，所得結果(表8)說明，超聲波輔助提取比回流提取的得率5．45%提高了16．8%，超聲波輔助提取提高了黃酮物質得率#65377;

3結論

研究證明：①運用Plackett－Burman試驗設計，從影響超聲波輔助提取鄂柑總黃酮工藝過程的眾多因子中高效地篩選出關鍵因素提取溫度#65380;溶劑分數#65380;液料比#65377;其他因素水平依次為超聲波功率100W，超聲波處理時間20min，提取次數2次，溶劑類型為乙醇，分級水平60目#65377;②通過中心組合設計和響應面分析實現了提取工藝參數的合理優化，總黃酮得率大于6．2%最佳提取條件為提取溫度54．8～58．9℃，溶劑分數40%～44．6%，液料比10～12．55 mL∶1g#65377;③提取得到的鄂柑總黃酮得率達到6．37%，縮短了提取時間，節約了提取溶劑#65377;超聲波輔助提取過程中的空化效應使得液體中的微小泡核在聲波作用下產生振蕩#65380;生長#65380;收縮#65380;崩潰等一系列刺激效應，加速了有效物質的釋放擴散和溶劑滲透作用#65377;

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