Ｃ５位上羥基對染料木黃酮抑制重組人蛋白激酶ＣＫ２活性的影響

【摘要】 目的 觀察染料木黃酮C5位上的羥基對其抑制重組人蛋白激酶CK2全酶活性的影響。方法 將利用基因工程技術獲得的重組人CK2α’及β亞基在體外等摩爾混合構成CK2全酶。通過測定藥物作用后轉移到CK2底物上的［γ32P］ATP的32P的放射性活度，探討染料木黃酮和大豆甙元對重組人CK2全酶活性的抑制作用，并采用半數效量概率單位法計算其IC50值。結果 染料木黃酮和大豆甙元能明顯抑制重組人CK2全酶活性，其IC50值分別是27.95 μmol/L和2.38 μmol/L，作用效果接近或者強于目前已知的CK2抑制劑N(2氨乙基)5氯萘1硫胺 (A3)。結構效應分析表明：C5位上的羥基可減弱染料木黃酮對重組人CK2全酶的抑制作用。結論 染料木黃酮和大豆甙元是兩種有效的重組人CK2全酶的抑制劑。

【關鍵詞】蛋白激酶CK2；全酶；染料木黃酮；IC50文章編號：1003-1383(2008)01-0001-04

中圖分類號：R284.1; R329.2; R345.57; R916.4; R977.3 文獻標識碼：A

Effect of 5 hydroxyl group of genistein on  recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity

LIN Xiaocong1，LIU Xinguang1，LI Chunmei2，CHEN Xiaowen3

(1.Institute of Biochemistry and Molecular Biology， Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023， China; 2. Department of Biochem istry，Guangdong College of Pharmacy， Guangzhou 510240， China; 3. Pediatrics Institute ofShenzhen Children's Hospital， Shenzhen 518026， China)

【Abstract】 Objective To observed the effects of 5 hydroxyl group of genistein on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity.

Methods Recombinant human protein kinase CK2α’and β subunits which were abtained by genetic engineering tecnology were mixed into reconstitute CK2 holoenzyme. the effects of 5 hydroxyl group of genistein on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity was study by detecting incorporation of 32P of ［γ32P］ATP.

Results Genistein and daidzein were shown to inhibit obviously recombinant CK2 holoenzyme activity in a concentrationdependent manner with IC50  values of 27.95，2.38 μmol/L，respectively，which display a close effect or more potent than previously known inhibitor N(2aminoethy1)5chloronaphthalene1sulfonamide (A3). Structureactivity study indicated that hydroxyl group at position 5 is detrimental per se for the inhibitory effects of genistein on CK2.

Conclusion Genistein and daidzein were two effective inhibitors of recombinant human protein kinase CK2 in vitro.

【Key words】 protein kinase CK2; holoenzyme; genistein; IC50

蛋白激酶CK2 是一種高度保守的第二信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶。全酶是由兩個催化亞基(α或α’) 和兩個調節亞基(β)組成的不均一四聚體(α2β2，α’2β2 或αα’β2 )［1，2］。CK2的α和α’基因是原癌基因［3］。在多種實體瘤細胞和白血病細胞中，CK2活性比相應的正常組織中高3～8倍［4，5］。轉基因小鼠淋巴細胞中的CK2α亞基的失控表達可導致淋巴瘤，CK2α亞基與原癌基因cMyc共表達或在p53表達被改變條件下，CK2α基因的表達可促進急性淋巴細胞性白血病的發生［2］。此外，CK2 與HIV1 的生命周期關系十分密切，它可在HIV1 的復制、轉錄及裂解細胞等功能的調控中起重要作用，一些CK2 抑制劑具有抗HIV1 活性［6］。Sarno等［7］指出，CK2在尋找抗腫瘤及抗病毒藥物方面是一個具有吸引力的分子靶點，其特異性抑制劑具有潛在的臨床應用價值。

黃酮類化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、利膽、強心、鎮痛和抗腫瘤等多種生物學活性并與蛋白激酶※基金項目：教育部科學技術研究重點項目(No 200303096)；廣東省科技計劃項目(No 2001011766)；廣東省衛生廳醫學科研基金項目 (No A2004454)

作者簡介：林小聰（1975-），男，廣東省湛江市人，生物化學講師，碩士。研究方向：蛋白激酶CK2的生化藥理學。 通訊作者：劉新光(1964-)，男，江西省九江市人，生物化學教授，博士，博士研究生導師。關系密切；多種黃酮類化合物能抑制蛋白激酶的活性［8］。染料木黃酮和大豆甙元作為兩種結構非常相似的黃酮類化合物（結構式見圖1），它們可能會影響CK2的活性。因此我們選擇染料木黃酮和大豆甙元作為研究的對象，在已克隆、表達和純化人CK2α’及β亞基的基礎上［9～11］，探討其對重組人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用，并觀察C5位上的羥基對其抑制作用的影響，為進一步尋找新型的抗腫瘤和抗病毒藥物奠定基礎。

材料與方法

1.材料和試劑 染料木黃酮和大豆甙元購自Aldrich公司；P81磷酸纖維素濾紙為Whatman公司產品；［γ32P］ATP為北京福瑞生物醫學工程公司生產。其余為國產分析純試劑。

2.實驗儀器 GB2002型電子分析天平為MettlerToledo儀器上海有限公司產； LS6000SC型液閃計數儀為Beckman公司產；UV2100型分光光度計為尤尼柯上海儀器有限公司產。

3.克隆、表達和純化人CK2α’和β亞基 人CK2α’和β亞基cDNA重組質粒pTCKA'和pTCKB的克隆與測序見我們以前的報道［9，10］。重組人CK2α’和β亞基的原核表達、純化與鑒定見我們以前的報道［9，11］。

4.體外重組人CK2的蛋白定量 按常規的考馬斯亮藍R250染色法，以牛血清白蛋白作為標準［12］。

5.體外重組人CK2的活性測定 酶反應總體積為35 μl，反應混合液中含：50 mmol/L TrisHCl，150 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 μmol/L ATP，［γ32P］ATP 1.85×104Bq(比活1.85×1017Bq/mol)，去磷酸化酪蛋白2 g/L，pH 7.2。反應溫度為30℃。將純化的重組人CK2α’與β亞基按等摩爾(14 pmol)混合構成重組人CK2全酶。加重組CK2全酶10 μl啟動酶反應，反應10 min后取30μl點至直徑2 cm的P81磷酸纖維素濾紙上終止反應，陰干，用85 mmol/L 磷酸洗滌8次，最后用丙酮洗滌1次，80℃烤干后，加閃爍液于液閃儀計數，每組同時做3個平行管。

6.染料木黃酮和大豆甙元對重組人CK2全酶的直接作用及半數抑制濃度(IC50)的計算 將純化的重組人CK2α’與β亞基按等摩爾(14 pmol)混合構成重組人CK2全酶。在每個反應管中分別加入10 μl不同濃度的受試化合物，加入15 μl反應混合液，以10 μl全酶啟動反應從而觀察受試化合物對CK2全酶活性的影響。IC50的計算根據半數效量概率單位法［13］進行。以濃度的對數為橫坐標，相應濃度抑制率的概率單位(probit)為縱坐標，求出直線回歸方程，并根據方程計算IC50值(50%抑制時的概率單位為5)。

7.統計學處理 以SPSS 11.0軟件做統計學數據處理，實驗結果用-±s表示，多組資料采用oneway ANOVA分析，組間的比較用Dunnett'st檢驗。

結果

1.染料木黃酮和大豆甙元對重組人CK2全酶的直接作用 將純化的重組人CK2α’與β亞基按等摩爾(14 pmol)混合構成重組人CK2全酶，以2 g/L去磷酸化酪蛋白作為底物，向反應體系中分別加入不同濃度的染料木黃酮和大豆甙元測定CK2的活性。實驗結果表明，染料木黃酮和大豆甙對CK2有較明顯的抑制作用，且隨著濃度的不斷增加其對CK2全酶的抑制率逐漸上升，呈現濃度依賴性關系（見表1和表2）。

2.染料木黃酮和大豆甙元對重組人CK2全酶直接作用的半數抑制濃度(IC50) 根據染料木黃酮和大豆甙元對重組人CK2活性抑制作用的結果，以濃度的對數為橫坐標，相應濃度抑制率的概率單位(probit)為縱坐標（見圖2和圖3），求出直線回歸方程分別為：Y=1.509X－1.7227， r2=0.9924 （染料木黃酮）；Y=0.3402X+3.9237， r2=0.9902（大豆甙元）。根據50%抑制率時概率單位為5，利用回歸方程計算相應的結果分別為27.95μmol/L和2.38 μmol/L。由此可見，大豆甙元對重組人CK2全酶活性的抑制效果要強于染料木黃酮。

討論

蛋白激酶CK2是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶。有學者指出，CK2可能是腫瘤和艾滋病治療的分子靶點之一，其特異性抑制劑具有潛在的臨床治療價值［7，14］。CK2又是一種多底物的蛋白激酶，迄今已發現其有300多種底物。CK2的許多底物如蛋白激酶A(PKA)、P34cdc2、P53、糖原合酶、鈣調蛋白、乙酰COA羧化酶、雌激素受體2、熱激蛋白90(HSP90)、酪蛋白磷酸酶1B以及胰島素受體底物1（IRS1）等參與信號轉導途徑［4］。其中，鈣調蛋白、p34cdc2和雌激素受體2，既可受PKC調節，又是CK2的重要底物［4，15］。此外，細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)以及糖原合酶激酶3(GSK3)等多種細胞代謝調節激酶的催化亞基與CK2的α 和α’亞基具有高度的同源性［15］。這些揭示了某些信號轉導、細胞代謝調節的激酶與CK2之間存在密切的相互關系，因此這些激酶的抑制劑均可作為CK2抑制劑的篩選化合物。

由于CK2在細胞內的含量較低，而且從組織中提取純化較為困難，因此我們通過基因工程方法獲得大量有生物學活性的重組人CK2［9～11］，然后將純化的重組人CK2α’與β亞基按等摩爾(14 pmol)混合構成重組人CK2全酶。全酶的性質鑒定表明重組人CK2全酶具有與天然CK2一致的性質，如可以酪蛋白作底物；而用堿性蛋白組蛋白ⅢS和TPK的底物Poly(Glu：Tyr)4∶1作底物時，CK2的活性則很低。另外，重組人CK2全酶的活性受到肝素和CK2特異性抑制劑DRB的抑制，精胺則有激活作用；而一些第二信使分子，如cAMP、cGMP和Ca2+則對CK2的活性基本沒有影響［16］。我們以此作為基礎來研究染料木黃酮和大豆甙元對重組人CK2全酶活性的影響。

N(2氨乙基)5氯萘1硫胺(A3)是目前公認的對CK2有抑制作用的化合物［1，4］，我們以前的研究表明［17］， A3對重組人CK2全酶有較強的抑制作用，其IC50值為25.5 μmol/L。本實驗結果表明：染料木黃酮 (IC50=27.95 μmol/L) 和大豆甙元 (IC50=2.38 μmol/L) 能明顯抑制重組人CK2全酶活性并呈濃度依賴性關系，其作用效果接近或者強于A3。由于染料木黃酮和大豆甙元結構非常相似（兩者僅相差一個C5羥基）；通過比較兩者對CK2的抑制效果，我們發現大豆甙元對CK2的作用效果要明顯強于染料木黃酮，說明C5位上的羥基可減弱染料木黃酮對重組人CK2全酶的抑制作用，可能是此類CK2抑制劑的非必需基團。根據這些抑制劑的結構特點及其作用規律，借助計算機輔助設計并利用化學方法（如通過消除一些非必需基團）在某些基本化合物的基礎上進行改造，我們可能會獲得一些更有效的CK2抑制劑。此外，本實驗結果也提示了染料木黃酮和大豆甙元是兩種有效的重組人CK2全酶的抑制劑。

參考文獻

［1］Litchfield DW. Protein kinase CK2: Structure， regulation and role in cellular decisions of life and death ［J］.Biochem J， 2003，369: 1-15.

［2］黃功華，劉新光，梁念慈.蛋白激酶CK2的研究進展［J］.生命的化學， 2003，23: 169-171.

［3］Xu X，Landesman-Bollag E，Channavajhala PL，et al. Murine protein kinase CK2: gene and oncogene ［J］.Mol Cell Biochem， 1999，191: 65-74.

［4］Pinna LA. Protein kinase CK2: a challenge to canons［J］.J Cell Sci， 2002，115: 3873-3878.

［5］Filhol O，Martiel J L，Cochet C.Protein kinase CK2: a new view of an old molecular complex［J］.EMBO Rep， 2004，5: 351-355.

［6］李春梅，劉新光，梁念慈.蛋白激酶CK2與HIV的生命周期［J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊， 2002，23: 208-211.

［7］Sarno S，Moro S，Meggio F，et al. Toward the rational design of protein kinase casein kinase-2 inhibitors［J］.Pharmacol Ther， 2002，93:159-168.

［8］黃華藝，查錫良.黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進展［J］.中國新藥與臨床雜志， 2002，21:428-433.

［9］陳小文，劉新光，梁景耀，等.人蛋白激酶CK2α’亞基在大腸桿菌中的克隆、表達及其重組蛋白的純化及性質鑒定［J］.中國生物化學與分子生物學報， 2004，20: 176-182.

［10］劉新光，梁念慈，馬澗泉， 等. 重組人蛋白激酶CK2β亞基cDNA的克隆與測序［J］.中國生物化學與分子生物學報， 1999，15:228-231.

［11］劉新光，梁念慈，馬澗泉.重組人CK2β亞基的原核表達、純化與鑒定［J］.生物化學與生物物理進展， 2000，27: 201-205.

［12］吳耀生. 新編生物化學實驗［M］.北京: 人民衛生出版社，2002，39-40.

［13］楊樹勤. 中國醫學百科全書——醫學統計學［M］.上海: 上海科學技術出版社， 1985，197-202.

［14］Guerra B，Boldyreff B，Sarno S，et al.CK2: A protein kinase in need of control ［J］.Pharmacol Ther， 1999，82:303-313.

［15］Blanquet PR. Casein kinase 2 as a potentially important enzyme in the nervous system［J］.Prog Neurobiol， 2000，60: 211-246.

［16］林小聰，劉新光，阮 杰，等.黃色黃素抑制人白血病HL60細胞內蛋白激酶CK2的實驗研究［J］.生物化學與生物物理進展， 2007，34: 187-195.

［17］劉新光，梁念慈.AG1109對重組人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用［J］.癌癥， 2002，21:153-157.

(收稿日期：2008-01-04 修回日期：2008-01-22)

(編輯：潘明志 英文審校：鐘京梓)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。