溶血對乙型肝炎病毒ＤＮＡ定量檢測的影響

【摘要】 目的 了解用實時熒光定量PCR技術檢測乙肝病毒DNA拷貝數(shù)時，溶血對乙型肝炎病毒DNA定量檢測的影響。

方法 采集30例乙型肝炎患者血液，分離血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，并同時配制出含不同濃度Hb血清管。采用實時熒光定量PCR方法，檢測含不同Hb濃度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)，用配對t檢驗進行統(tǒng)計處理。結果 當標本中Hb濃度小于32 g/L時，Hb對檢測血清乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。結論 當Hb濃度較低時，Hb對血清乙型肝炎病毒DNA定量檢測無顯著影響，因此較低濃度溶血標本可以進行乙型肝炎病毒DNA的定量檢測。

【關鍵詞】 乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR

文章編號：1003-1383(2008)01-0053-02中圖分類號：R 620.446.11文獻標識碼：A

血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判斷乙型肝炎病毒在體內是否復制，患者傳染性高低及選擇治療方案的重要指標。目前臨床一般采用實時熒光定量PCR技術對乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)進行定量檢測。實時熒光定量PCR技術融匯了PCR技術的高效擴增，探針技術的高特異性，光譜技術的高敏感性等優(yōu)點，通過直接檢測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結果。但此技術可能與標本狀態(tài)密切相關，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代謝產物可能與Taq酶相互作用，進而抑制Taq酶的活性，使PCR擴增效率明顯降低，導致定量測定結果偏低［1］。在臨床檢驗標本中，溶血標本較為常見，究竟溶血到何種程度會對乙型肝炎病毒DNA定量結果產生影響？本文將探討不同程度溶血對乙型肝炎病毒DNA定量檢測的影響。

對象與方法

1.對象 我們收集了ALT＞40 U/L、HBsAg陽性、HBeAg陽性、HBcAb陽性的乙型肝炎患者30例，其中男性17例，女性13例，年齡在18～53歲之間。

2.試劑 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA檢測試劑盒（批號：20070501）、乙型肝炎病毒DNA陽性標準品。

3.儀器 BECKMAN全自動血球計數(shù)儀（型號：Coulter Ac.Tdiffe）、Lightcycle熒光PCR擴增儀(羅氏公司)、高速低溫離心機（Sigma公司）、干式恒溫器（杭州藍焰科技有限公司）、低溫冰箱（SANYO公司）。

4. 方法

（1）模擬溶血標本的制備：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小時內離心分離血清，這種不含Hb的血清作為無Hb對照組，然后取每位患者600 μl血清及適量紅細胞混合，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。次日將含紅細胞的血清管取出放于室溫解凍，完全解凍后再將該管置于-20℃冷凍，如此反復凍融兩次，使得RBC完全破裂，釋放出Hb。在Coulter全自動血球計數(shù)儀測定每管紅細胞裂解后的Hb濃度，再用每位患者的血清稀釋，使得Hb終濃度為4 g/L、8 g/L、16 g/L、32 g/L，這些標本即為模擬溶血標本。

（2）乙型肝炎病毒DNA模板制備：取待測樣本及陰、陽性對照（試劑盒備有）各100 μl，分別加入到0.5 ml的離心管中，再分別加入100 μl DNA提取液1，震蕩混勻，13000 rpm離心10 min；吸棄上清液，再加入25 μl提取液2，震蕩至沉淀完全散開，100℃干浴10 min；冷至室溫后，13000 rpm離心10 min，保留上清液備用。

（3）PCR擴增：從試劑盒中取出乙型肝炎病毒DNA擴增反應液、Taq酶及UNG，室溫融化后按規(guī)定比例混合均勻，根據(jù)試劑盒說明書配置反應液，分裝于Roche毛細擴增管中，每次實驗均設2管陰性對照，1管強陽性對照，1管臨界陽性對照， 4管乙型肝炎病毒陽性工作標準品，其拷貝數(shù)分別為〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷貝/ml，將上述對照及樣本各加2 μl于加好反應液的Roche毛細管中，短暫離心后上機擴增。對檢測結果高于5.0×107拷貝/ml的標本進行稀釋后再擴增，使其結果落在試劑盒檢測線形范圍內。

（4）核酸擴增與熒光數(shù)據(jù)采集：擴增條件設置為37℃孵育3分鐘； 94℃變性1分鐘；再進入40個循環(huán)，每一個循環(huán)包括92℃變性5秒，60℃退火及延伸30秒，在60℃時單點收集熒光信號；儀器檢測通道選擇F1通道。

（5）分析條件設定：選擇F1通道，點擊Quantification進入定量分析窗口，設定Analysis方式為proportional，選定Noise bank項，閾值選定為剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)據(jù)為準。

（6）數(shù)據(jù)分析：四個陽性標準品Ct值均須小于38.0，標準曲線的擬合度須小于-0.980，陰陽對照品擴增須符合預期要求，得出的待測樣品的拷貝數(shù)才為可信結果。

5.統(tǒng)計學處理 將測得的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)轉換成常用對數(shù)，再利用SPSS軟件包進行統(tǒng)計，各含Hb的血清組與無Hb的血清組間差異采用配對t檢驗進行差異性檢驗。

結果

Hb為4、8、16、及32 g/L的血清組中乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)與無Hb的血清組分別進行配對t檢驗，P值均大于0.05，因此每一組含Hb的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)與不含Hb的血清組均無顯著性差異。見表1。

討論

實時熒光定量PCR技術檢測乙肝病毒DNA已在臨床廣泛使用，但在臨床應用中，影響的因素也較多，如實驗室條件，操作人員的技術，臨床標本的狀態(tài)等。一些研究認為溶血標本對FQPCR技術檢測乙肝病毒DNA有影響，但也有研究認為這種影響并不顯著［2］。本文通過模擬不同程度溶血標本，認為溶血達到32 g/L對檢測結果無顯著影響（P＞0.05）。陳英劍等認為溶血至20 g/L時對檢測結果無影響，這與本文研究結論基本一致［3］。

本文將乙型肝炎患者抽血后2小時內分離的血清作無Hb對照組，然后通過反復凍融使標本溶血，再用乙型肝炎患者自身血清稀釋以獲得不同Hb濃度溶血標本，在模擬不同程度溶血標本過程中，不添加任何外來物質，使檢測結果受外在因素影響程度減少到最低。實驗結果經統(tǒng)計處理后，發(fā)現(xiàn)溶血程度控制Hb的濃度在32 g/L以下時，對乙型肝炎病毒DNA的檢測結果無顯著影響（P＞0.05）。出現(xiàn)此結果的原因可能有兩個方面，一是在HBVDNA模板的提取過程中，標本中的Hb經100℃煮沸10分鐘后已經變性沉淀，再經離心后，待測樣本上清液中可能不會有Hb的存在，僅剩Hb的衍生物［4］。而且隨著提取方法的不斷改進，提取液中對DNA聚合酶的干擾物質不斷減少，去除Hb越來越徹底。另一方面FQPCR對乙肝病毒DNA定量檢測只是一種半定量方法，并不是對擴增后終產量進行完全定量，它是根據(jù)樣本可檢測的起始擴增時間與標準品擴增曲線得出的半定量結果。本文收集的30例病人的血清中HBVDNA含量均大于107 拷貝/ml，樣本中HBVDNA含量較高，血清中HBVDNA含量小于107 拷貝/ml時，檢測結果是否有差異，尚需進一步研究。且本文只對溶血程度小于32 g/L時進行探討，溶血大于32 g/L時對檢測結果的影響，也需進一步驗證再作結論。溶血程度達到32 g/L時已是肉眼非常清晰可見，臨床溶血樣本的溶血程度大多在32 g/L以下，因此我們認為一般的溶血樣本可以接受。但需注意的是，本文只是對深圳匹基公司試劑進行探討，不同廠家，可能因使用不同的提取液及提取方法而出現(xiàn)不同的結論，有文獻報道，使用PEG沉淀煮沸法和直接加熱煮沸法提取HBVDNA所得的定量結果有差異，因此不同提取方法對檢測結果有一定的影響［5］。一般而言廠家提供試劑時會給出較為清晰的影響試劑盒使用的各種因素，有能力的PCR實驗室在試劑使用前，可進行此類評價實驗，制訂合適本實驗室使用標本留取標準。隨著衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，人們對檢驗質量的的要求越來越高，但檢驗質量不可避免的受較多因素影響，標本質量是重要的影響因素之一，如溶血、脂血、餐前、餐后等，對各項影響因素進行量化研究，如溶血、脂血達到何程度時則定為不合格樣本，都應該有明確的指標。本文只對溶血程度小于32 g/L時進行探討，溶血大于32 g/L時及血清中HBVDNA含量小于107 拷貝/ml拷貝時對檢測結果的影響，需進一步驗證再作結論。

參考文獻

［1］黃 翔，王日軍，周志明，等.溶血和脂血標本中乙肝病毒DNA提取方法的選擇與評價［J］.華中醫(yī)學雜志，2004，28（02）：123-124.

［2］李金明，王露楠. 樣本處理對聚核酶鏈反應測定乙肝病毒核酸的的影響［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2000，23（6）：337-339.

［3］陳英劍，胡成進，齊法蓮，等.溶血對熒光定量PCR檢測HBV DNA結果的影響［J］.國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2004，25（6）：563-564.

［4］陳曉東，陶志華，周 武.核酸提取方法在聚合酶反應測定乙肝病毒核酸中的評價［J］.中華檢驗雜志，2002，25(04)：212.

［5］程正江，付文榮，曾平凡.熒光定量聚合酶鏈反應直接檢測血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及評價［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2004，27（2）：102-103.

(收稿日期：2007-10-10 編輯：潘明志)