信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子４及γ－干擾素在銀屑病患者皮損中的表達(dá)及其意義

【摘要】 目的 研究銀屑病患者皮損內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)及γ-干擾素（IFN-γ）的表達(dá)及其臨床意義。方法 利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)定20例尋常型銀屑病患者皮損內(nèi)及17例正常對(duì)照者皮膚中STAT4 mRNA及IFN-γmRNA的定量表達(dá)，采用直線相關(guān)回歸分析方法分析STAT4mRNA及IFN-γmRNA的表達(dá)與銀屑病病情嚴(yán)重指數(shù)（PASI）的相關(guān)性，STAT4mRNA與IFN-γmRNA表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 銀屑病皮損內(nèi)STAT4mRNA及IFN-γmRNA的表達(dá)均高于正常對(duì)照者皮膚內(nèi)的表達(dá)水平（P＜0.001）。銀屑病皮損內(nèi)STAT4mRNA的表達(dá)與患者PASI呈顯著的正相關(guān)(r=0.78465，P＜0.0001)， IFN-γmRNA的表達(dá)與患者PASI無顯著相關(guān)性(r=-0.16125，P=0.4970)。銀屑病皮損內(nèi)STAT4mRNA的表達(dá)與IFN-γmRNA的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)(r=0.62149，P=0.0034)。結(jié)論 STAT4可能通過上調(diào)IFN-γ的表達(dá)，促進(jìn)銀屑病的炎癥進(jìn)程。

【關(guān)鍵詞】 銀屑病；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4；γ-干擾素；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

文章編號(hào)：1003-1383(2008)05-0528-03中圖分類號(hào)：R 758.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Expression and significance of STAT4 and interferon gamma in patient with psoriasis

LI Changxing1，MA Zelin1，HAN Chunlei1，ZHOU Zhigang1，HU Bin2

(1.Dongguan Hospital of Chronic Disease，523008 Dongguan；

2.Da An Gene center of Sun Yat-Sen University，510080 Guangzhou)

【Abstract】 Objective To study the expression and significance of signal transducers and activators of transcription 4 (STAT4) and interferon gamma (IFN-γ)in psoriatic skin lesion.

Methods Twenty adult patients with vulgaris psoriasis and 17 health control were sequentially enrolled in this study. The production STAT4 mRNA and IFN-γmRNA was detected by real-time polymerase chain reaction. The relationship between STAT4 and disease severity (PASI) was assessed by correlation analysis. The relationship between IFN-γ and PASI was assessed by correlation analysis. The relationship between STAT4 mRNA and IFN-γmRNA was assessed by correlation analysis.Results Expression of STAT4 mRNA and IFN-γmRNA in psoriasis lesional skin was higher than that in control subject （P＜0.001）.Expression of STAT4 mRNA was markedly positive correlation with PASI(r=0.78465，P＜0.0001). Expression of IFN-γmRNA was negative correlation with PASI(r=-0.16125，P=0.4970). Expression of STAT4 mRNA was markedly positive correlation with IFN-γmRNA (r=0.62149，P= 0.0034).Con

clusion Over expression of IFN-γ might be regulated by STAT4. STAT4 might play an important role of in the development and advance of psoriasis.

【Key words】 psoriasis；signal transducers and activators of transcription 4；interferon gamma；real-time polymerase chain reaction

銀屑病是一種慢性炎癥性增生性疾病，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，人群發(fā)病率為0.5%～4%，Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡紊亂可能在銀屑病發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用［1，2］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄因子，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等7個(gè)成員［3］。STAT家族作為轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子發(fā)生作用的信號(hào)通路，是Th1細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，但STAT4在銀屑病中的表達(dá)情況及其臨床意義的研究甚少。本研究采用熒光定量PCR法定量測(cè)定STAT4及IFN-γ在銀屑病患者皮損內(nèi)的表達(dá)及探討其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料和方法

1.一般資料 20例尋常型銀屑病患者為2006年1～6月東莞市慢性病防治院皮膚科門診患者（進(jìn)行期），其中男11例，女9例；年齡范圍20～46歲（平均36.8歲）；病程10天～3年。所有患者治療前2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)應(yīng)用免疫抑制劑或皮質(zhì)類固醇制劑或中藥機(jī)制；銀屑病皮損嚴(yán)重指數(shù)（PASI）為8.9～48.6（平均30.1）。正常對(duì)照者17例為健康者外科整形手術(shù)切除的皮膚，其中男9例，女8例，年齡范圍20～46歲（平均36.8歲）。

2.方法

（1）RNA的提取：組織塊置勻漿器，加TRIZol冷凍勻漿，提取后的RNA置-80℃保存?zhèn)溆谩＊?/p>

（2）RNA樣品鑒定：電泳檢查：每樣品取5μl RNA置1%的瓊脂糖凝膠上電泳，泳畢，溴化乙錠染色20 min，置紫外燈下觀察。紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度值及計(jì)算樣品濃度。

（3）引物的設(shè)計(jì)和合成:參考16 sRND基因文庫(kù)設(shè)計(jì)引物，STAT4引物序列如下：FO:5’- CAT TTG GTA CAA CGT GTC AAC CA -3’，RO:5’-TGT GGC AGG TGG AGG ATT ATT A -3’，引物擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為70 bp，TaqMan Probe:5’-FAM-CGA TTC CCA GAA CTT GGT TTT CT-TAMRA-3’。 IFN-γ引物序列如下：Forward Primer:5’-TAGCA ACAAA AAGAA ACGAG-3’，Reverse Primer:5’-CAGGA CAACC ATTAC TGGGA-3’擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為117 bp，TaqMan Probe:5’-CCAAC GCAAA GCAAT ACATG AACT-3’，由ABI 3900臺(tái)式高通量DNA合成儀合成。

（4）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取4 μl RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，儀器為PE9700 PCR儀，反應(yīng)體系如下： 5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μl，上游引物（10 pM/μl）0.4 μl，下游引物（10 pM/μl）0.4 μl，dNTPs（25 mM）0.2 μl，MMLV（10 U/μl）1 μl， DEPC水10 μl，總體積20 μl。反應(yīng)條件：37℃ 1 h，然后95℃3 分鐘。

(5)熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行：由熒光定量?jī)xPE 7000型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增完成。反應(yīng)體積為50μl，反應(yīng)體系：5×定量PCR buffer 10μl，上游引物F1 μl，下游引物R 1 μl，dNTPs 0.5 μl，熒光探針1 μl，Taq 酶1.5 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 30 μl。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃45秒，55℃45秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算待測(cè)樣本STAT4 mRNA及IFN-γmRNA表達(dá)量(copy/μg RNA)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 8.01 for window 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用秩和檢驗(yàn)和直線相關(guān)回歸分析。

結(jié)果

1.兩組STAT4 mRNA的表達(dá) 銀屑病患者皮損內(nèi)STAT4 mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照者皮膚中的表達(dá)（表1）。

2.兩組IFN-γ mRNA的表達(dá) 銀屑病患者皮損內(nèi)IFN-γ mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照者皮膚中的表達(dá)（表2）。

3.銀屑病患者STAT4mRNA、IFN-γmRNA與病情PASI的相關(guān)性 銀屑病中STAT4mRNA表達(dá)與病情PASI呈顯著正相關(guān)性(r= 0.78465，P＜0.0001)，銀屑病中IFN-γmRNA表達(dá)與病情PASI無顯著相關(guān)性(r=-0.16125，P=0.4970)，銀屑病患者皮損內(nèi)STAT4mRNA的表達(dá)與IFN-γmRNA的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)性(r=0.62149，P=0.0034)。

討論

銀屑病是一種Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞平衡紊亂的炎癥性疾病。大多數(shù)的研究顯示銀屑病患者外周血和皮損內(nèi)以Th1細(xì)胞為主，Th1細(xì)胞因子抑制劑能有效的治療銀屑病［1，2，4，5］。銀屑病皮損的炎癥與T細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有關(guān)，其皮損的表皮增殖與細(xì)胞凋亡異常相關(guān)：相關(guān)研究顯示患者皮損內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)過度［2］，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞和CD4+/IFN-γ+細(xì)胞表達(dá)明顯升高，血清IFN-γ含量明顯升高并與PASI成正相關(guān)但與病程無關(guān)［2］，這些研究表明IFN-γ可能參與了銀屑病的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者和健康者皮膚均有IFN-γmRNA的表達(dá)，但銀屑病患者的表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照者。此外，銀屑病患者皮損內(nèi)IFN-γmRNA的表達(dá)與病情嚴(yán)重程度呈顯著的無顯著相關(guān)性，與前期研究［2］的患者血清學(xué)表達(dá)的差異可能的原因有：①樣本量不同，②血液和樣本來源不同，③研究方法不同。提示銀屑病患者體內(nèi)Th細(xì)胞分化呈偏態(tài)性，以Th1細(xì)胞為主［1］。

患者體內(nèi)IFN-γ過度表達(dá)促進(jìn)了銀屑病皮損的形成和發(fā)展，但銀屑病患者體內(nèi)是通過何種信號(hào)途徑促進(jìn)Th細(xì)胞分化呈偏態(tài)性，如何促進(jìn)IFN-γ過度表達(dá)的研究甚少。STAT4是T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬／枯否細(xì)胞等免疫調(diào)控細(xì)胞內(nèi)IL-12／STAT4／IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組成元件，是IL-12誘導(dǎo)免疫調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的關(guān)鍵調(diào)控因子。在STAT4基因敲除小鼠，IL-12誘發(fā)的所有主要的T細(xì)胞和NK細(xì)胞功能反應(yīng)均明顯減弱，其中包括IFN-γ產(chǎn)生減少與Th1型反應(yīng)減弱；除此以外，STAT4還能調(diào)控T細(xì)胞IL-12受體和IL-18受體表達(dá)以及T細(xì)胞NF-KB激活［6，7］。因此，STAT4作為IFN-γ產(chǎn)生的關(guān)卡，通過直接與間接途徑調(diào)控IFN-γ的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者和健康者皮膚均有STAT4mRNA的表達(dá)，但銀屑病患者的表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照者，與Eriksen等人［4］報(bào)道的基本一致。銀屑病患者皮損內(nèi)STAT4mRNA的表達(dá)與病情嚴(yán)重程度呈顯著的正相關(guān)，即STAT4mRNA的表達(dá)量越高其病情越重，反之亦然。此外，銀屑病皮損內(nèi)STAT4mRNA的表達(dá)與IFN-γmRNA的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，銀屑病患者STAT4的過度表達(dá)可能直接與間接促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，最終形成銀屑病皮損。

參考文獻(xiàn)

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(收稿日期：2008-08-19 修回日期：2008-10-05)

(編輯：潘明志 英文審校：唐雄林)