葡萄ＭＡＤＳ－ｂｏＸ家族基因保守片段的克隆與序列分析

(南京農業大學園藝學院，南京210095；²延邊大學農學院，龍井133400；³江蘇省農業科學院園藝研究所，南京210014)摘要：MADs_box轉錄因子在多種植物的發育過程特別是花器官和果實發育過程中發揮重要的作用。為了從葡萄中克隆出新的MADS_box基因，研究在葡萄花及果實發育中的作用，根據多種植物MADS_box基因保守區序列，設計簡并引物，應用RT-PCR技術從紅富士葡萄花序中分離出34條MADS-box基因cDNA片段。序列分析表明，這些片段長度在138～152 bp之間，包含基因起始密碼子。推導的氨基酸序列與已登錄的歐洲葡萄及其它物種的MADS—box基因同源性超過83％。用推導的氨基酸序列與已知的歐洲葡萄和擬南芥MADS—box家族基因進行系統發育分析，可將這些基因片段分別歸人擬南芥MADS-box基因不同亞家族中。證明葡萄中存在多種MADS—box家族基因，克隆的片段包含AllCDE模型中的各類花發育基因。

關鍵詞：葡萄；MADS—box gene－RT-pcR；序列分析

中圖分類號：s663，1 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980(200810l－27－06

MADS-box是一個保守性很強的DNA結合結構域，最早在酵母Miini Chramatsome Maintenancel(MCMl)、擬南芥AGAMDUS(AG)、金魚草DEFI-CIENS(DEF)和人類血清應答因子Serum ResponseFactor(SRF)中發現，因此具有此結構的功能基因被-命名為MADS box基因^[1-2]。研究結果表明，在植物花器官發育中MADS_box蛋白基因起著非常重要的作用^[3-4]。通過對該調控蛋白的深入研究，科學家提出了控制花器官發育的ABC模型^[5]，該模型認為。A、B、C分別代表3類不同的同源異型基因，A類基因單獨作用形成花萼，A類和B類基因共同作用形成花瓣，B類和C類基因共同作用形成雄蕊，C類基因單獨作用形成心皮，其中A類和c類基因相互抑制，3類基因在花的發育調控中有各自的位置效應。除ABC類基因之外，在矮牽牛中發現的D功能基因FBPll是控制胚珠發育的重要基因，從而產生了ABCD模型^[6-7]隨著研究的深入，發現SEPl、SEP2、SEP3是擬南芥中花瓣、雄蕊、心皮的正常發育所必需的另一類基因——E類基因^[8]因此花發育模型也被發展成ABCDE模型^[9]。葡萄是世界范圍內的重要果樹，其花發育有很多獨特的特點^[10]，研究其花器官的發育乃至果實的形成具有重要的理論和實踐意義。我們利用MADS-box基因的保守性特征，從葡萄花序中分離和克隆了34條MADS-box基因保守片段，并對這些片段進行了系統發育分析，為克隆葡萄有關花發育的新的MADS-box家族基因，研究葡萄花發育的分子機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紅富士葡萄(Vitis vinifera×V.1abntsca)葉片、花序采自江蘇省農業科學院園藝研究所葡萄園，用液氮速凍后，保存在70℃冰箱中備用。

1.2 總RNA的提取及檢測

采用CTAB法^[13]，略有改進。取200mg葉片和花序樣品，在液氮中研成粉末，加600 txL 65℃預熱的提取緩沖液[1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 m mol/L EDTA，2％CTAB，2％PVP，l％B－巰基乙醇(用前加入)]，渦旋2～3 min，65℃水浴20-30 min，中途渦旋2～3次。加0.6倍體積氯仿，充分混合，冰浴5min。4℃，12 000 r/min離心10min，取卜清液。向上清液中加入1/3體積的10 mol／L LiCl，混合均勻，20℃放置12h。4℃12 000 r/Min離心10rain，棄上清，70％乙醇清洗沉淀。沉淀干燥后，加800 μL DEPC-H20溶解。加0.8倍體積酸酚/氯仿(1：1)充分混合，室溫靜置5 rain。4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。加0.8倍體積氯仿抽提1次。取上清，加1/10體積3mol，LNaAc(pH 5.2)和二倍體積無水乙醇沉淀RNA，-20℃放置1-2h4℃，12 000 r/min離心10min，收集RNA。70％乙醇洗滌，用30μL DEPC-H²O溶解RNA。用紫外分光光度計檢測吸光度值，在1％非變性瓊脂糖凝膠上電泳檢測，注：除Tris-HCl用滅菌后的DEPC處理過的ddH²O配制外，其余試劑、器皿應該用DEPC處理過的ddH20來配制或經處理后使用。

1.3 CDNA第一鏈的合成

用寶生物工程(大連)有限公司(Takara)M-MLV(RNase H一)反轉錄酶合成eDNA第1鏈。以Oligo(dT)。。為反轉錄引物，起始RNA為lμg總RNA，其余操作均按說明書進行。

1.4 RT-PCR

根據多種植物的MADS-box基因的MADS-保守區設計上下游各3條簡并引物，序列分別為：上游引物：MI：5’ATGGGRAGRGGDARRGTBCA 3’

M2：5’ATGGGRAGRGGDARRGTBGA 3。

M3：5’ATGGGRAGRGGDARRATHGA 3’下游引物：M4：5’ATSARRGCDACYTCDGCRTC 3’

M5：5’CKYTCNARDATNCKYTCCAT 3’

M6：5’GAGAAGAYGATSARRGCDAC 3’

其中R：A or G；D：not C：B：not A；H：not G；Y：C0r T；K：G 0r T，S為C 0r G；N：A，c；G or T)。將這6對引物配成引物組合(表1)。 RT-PCR反應體系：25 p，L總反應體積含模板第1鏈eDNA 1 μL，上下游引物各1 IxL(20 μmol/L)，dNTP Mixture 1.5 IxL(2.5 mmol/L each)，MgCl² 1.5μL(1.5 mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5Unit/μL)，10xBuffer 2.5μ，其余用重蒸餾水補充。PCR反應條件為：94℃5 min；94℃45^s，43-53℃45 ^s，72℃l min，35個循環：72℃延伸10 min。將擴增得到的cDNA片段用Takara PCR產物純化試劑盒純化后。與PMDl9-T載體(Takara)連接，然后轉化大腸桿菌DH5a，經藍白斑篩選，菌液PCR(M13通用引物)篩選陽性克隆，每個組合各挑10個陽性克隆，送上海博亞生物公司測序，測得的序列按引物組合分別編號。

1.5 序列及系統發育分析

將獲得的序列及其推導的氨基酸序列在NCBI上進行Blast分析，確認是否為預計的MADS-box基因保守片段，然后用DNASTAR軟件將其氨基酸序列與GenBank數據庫登錄的葡萄及擬南芥中的MADS-box蛋白序列用Clustalw法進行比對，并生成系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 RNA提取

提取的RNA經紫外分光光度計檢測，D^260nm/D^280nm。在1.9～2.0之間，濃度在500mg/L左右。說明提取的RNA純度和濃度均較高，且基本去除了DNA和蛋白污染。提取的RNA邊緣清晰，28S rRNA亮度約為18S rRNA的2倍，說明RNA質量很好，基本無降解(圖1)。紫外和電泳分析結果均表明，相同質量的初始材料中葉片中提取的總RNA量比花序高。

2.2 RT-PCR擴增葡萄MADS-box基因保守片段

應用9個引物組合對葡萄花序cDNA進行RT-PCR反應(圖2)。在上述9個引物組合中，有6個引物組合(圖中為其中的5個組合)擴增出一條大約150bp的特異條帶，與預計的片段大小基本一致。將條帶分別回收并克隆于PMDl9-T載體，經藍白斑篩選，通用引物PCR鑒定后，每個引物組合分別選10個克降送上海博亞生物工程公司測序。

2.3 序列及系統發育分析

測得的核苷酸序列片段長度為138-152 bp，在NCBI上進行BLAST分析，發現有34個片段序列與已知的歐洲葡萄MADS-box基因的同源性從80％到99％不等，其核苷酸序列及其與歐洲葡萄MADS-box基因相應區域多序列比對結果見圖3。推導的氨基酸序列同源性均超過83％，說明得到的片段是葡萄MADS-box基因的M_ADS保守區。對這34個片段的核苷酸序列比對發現這些片段核苷酸序列均不相同，說明通過同一對簡并引物能擴增出不同的MADS保守片段。

將從獲得的片段推導的氨基酸序列與已知的葡萄和擬南芥MADS-box類蛋白進行比對，構建系統發育樹狀圖，并根據Becker等^[12]的分類方法，將獲得的片段進行歸類(圖4)。從圖中可知，獲得的片段被劃分到不同的MADS-box亞家族中，其中多數屬于花器官特征基因。其中序列15、33、17、37、6l劃分在SQUA組中，為APl基因亞家族的成員，屬于A類花發育基因；70、75、91、74劃分在DEF/GLO組中，為AP3/P1亞家族成員，屬B類花發育基因；78、95、94、7l、90、96被劃分在AGAMOUS組中，屬花器官發育的C、D類基因；43、39、41、42、63、69劃分在AGL2組中，為SEP類基因亞家族的成員，屬于E類花發育基因。其余序列聚在非花MADS-box基因亞家族中。73、77、99、66聚在STMADSll組中；68、32、38劃分在AGL6組巾；18屬于AGLl2亞家族成員：60聚在FLC組中，而62聚在其它類MADS-box基因中。以上結果表明。克隆的MADS-box基因保守片段分屬于不同的亞家族，包含A-E類花發育基因和非花MADS-box基因，可能在葡萄花及其它發育過程中起著不同的作用。

3 討論

控制花發育的同源異型基因多為MADS-box基因，該類基因屬于一個龐大的基因家族。在植物中廣泛存在，曾認為在每種植物中約有25～30種MADS－box基因^[13]，但最近研究發現擬南芥全基因組有107個基因編碼MADS盒蛋白，且其中84％的基因功能未知^[14]，未來對MADS-box基因功能的研究將成為倍受關注的領域。本研究結果表明，在葡萄中存在大量的MADS-box基因，目前僅對部分基因的表達模式和功能進行了研究^[15]，還有很多基因的功能未知。作為目前植物界中了解最多的調節基因家族，MADS-box基因表達模式的多樣性和功能的復雜性證明其內在機制的復雜性^[12]。近來的研究發現。在植物進化過程中發生了大量的基因重復現象，從而形成了一個多基因家族，產生了MADS-box表達模式的多樣性及基因功能的分化，也出現了基因功能冗余現象^[12-16]，本研究發現葡萄中也可能存在基因重復和功能冗余現象，例如有6個基因片段聚在AGAMOUS基因亞家族中，但這些片段的序列并不相同。

MADS-box基因家族的成員根據其序列結構特征分為typeI和typeII 2種類型，在植物中，typeI類MADS-box基因的功能仍不清楚，所有已知功能的基因都屬type II基因^[17-18]。種子植物MADS-box蛋白非常相似，具有MADS(M)，Intervening(I)。Karatin-like(K)和C-端(C)4個結構域，所以又稱為MIKC一類MADS-box基因，N-端MADS結構域最為保守。一般為DNA結合位點。基于這個特點，合成簡并引物，通過RT-PCR的方法，可從植物中分離MADS-box基因。通過對處于不同進化地位的被子植物各類群中分離得到的大量的MADS-box基因進行了系統發育重建，將被子植物中的MADS-box基因可以分成12個主要的亞家族^[12]。本研究得到一系列葡萄MADS-box基因的保守區片段，系統發育分析將其分別歸入不同亞家族中，包含了花發育ABCDE模型的各類基因，說明MADS-box基因在葡萄中廣泛存在。但仍有一些亞家族沒有相應的片段聚在其中，說明通過這些簡并引物可能得不到葡萄中全部的MADS-box基因，或者有些基因并不在花序中表達，解決這些問題，就有可能全面了解MADS-box在葡萄發育中的功能。

4 結論

應用簡并引物和RT-PCR從紅富士葡萄花序中克隆了34個MADS-box家族基因片段，長度為138-152 bp，推導的氨基酸序列與葡萄或其它物種的MADS-box基因同源性在83％以上，系統發育分析可將這些片段歸人擬南芥MADS-box家族基因的不同亞家族中，包含了花發育ABCDE模型中的各類基因，說明bfADS-box基因在葡萄中廣泛存在，有可能發揮多種重要功能。本研究為進一步得到基因全長，研究其功能及其相互作用，闡明其在葡萄花發育中的作用奠定了基礎。