Ｆｏｌｉｎ－酚法測定水果及其制品中總多酚含量的條件

摘 要：對Folin-Denls法和Folin－Ciocalteus法測定水果及其制品中總多酚含量進行了研究。Fohn－Ciocaheus法比Folm-Denis法更加穩定、靈敏和準確。經過一系列優化實驗，提出Folin-Ciocalteus法的最適測定程序為1.0mL樣品提取液中依次加入5.0mL水、1mL顯色劑和3mL7.5％碳酸鈉溶液，搖勻，顯色2h，在765 nln波長下測定吸光度。采用此程序，蘋果、梨、香蕉、柿子、葡萄和葡萄酒等6種試材的沒食子酸平均添加回收率為77.2％～112.1％，方法誤差為0.8％-5.7％。

關鍵詞：水果及其制品；總多酚含量；測定條件；Folin-Cioeaheus法；Folin-Denis法

中國分類號：S66 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2008)01-126-06

多酚廣泛存在于水果及其制品中，水果多酚具有生物活性，能發揮抗氧化、抗衰老、捕捉自由基、防癌、防紫外線等功效^[1-4]。其提取與應用研究日益受到重視。水果中多酚含量的高低直接影響到水果本身及其制品的風味和品質，未成熟的柿子、蘋果、香蕉等水果因多酚含量較高而有明顯的澀味。水果加工過程中多酚可能引起褐變和混濁，多酚還有助于穩定水果加工品的色澤，并使水果加工品產生特殊風味^[4-6]。水果及其制品中多酚含量的測定常用Folion-酚法^[7-8]，該方法又分為Folin-Denis法(簡稱FD法)和Folin-Ciocaltens法(簡稱FC法)2種。FD法在加入碳酸鈉溶液顯色時，對環境溫度要求較嚴格，容易出現沉淀，顯色較不穩定^[9]。FC法是FD法的改進方法，在FD試劑基礎上加入鋰鹽，克服了FD試劑不穩定的缺陷，較之更為靈敏，吸收峰也較為狹窄，對酚的選擇性比FD法高^[4]。目前尚未見有2種方法比較的文獻報道。本文選取有代表性的水果和水果制品為試材，對FC法和FD法進行了對比研究，選擇FC法對測定條件進行了優化，建立了最適測定程序。

1 材料和方法

1.1 試劑

1.1.1 藥品 鎢酸鈉(Na₂WO₄·2H₂O)、鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O)、硫酸鋰(Li_[2]sO₄)、磷酸(H₃PO₄ 85％)、磷鉬酸(24MoO₃-P₂O₅·xH₂O)、碳酸鈉(Na₂CO₃)、鹽酸和溴水為分析純。一水合沒食子酸標樣為Sigma-Aldrich公司產品。水為蒸餾水。

1.1.2 FC顯色劑 稱取50.0 g鎢酸鈉和12.5 g鉬酸鈉，用350 mL蒸餾水溶于1 000 mL回流瓶中，加入25mL磷酸和50mL鹽酸，混勻，微沸回流2 h.加入75.0 g硫酸鋰、25mL蒸餾水和數滴溴水，開口沸騰約15min(至溴水揮盡為止)，冷卻，定容至500mL，過濾。置棕色瓶中保存備用。使用時加入1倍蒸餾水稀釋。1.1.3 FD顯色劑稱取100.0 g鎢酸鈉和20.0 g磷鉬酸，溶于200mL蒸餾水，加入5mL磷酸。加熱回流2 h，冷卻，定容至lL。

1.1.4 7，5％碳酸鈉溶液稱取37.5 g碳酸鈉，溶于250mL溫水，混勻，冷卻，定容至500mL。

1.1.5 一水合沒食子酸標準溶液稱取0.110 g-水合沒食子酸，用蒸餾水溶解、定容至100 mL，此溶液質量濃度為1 000 mg/L。分別吸取此溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，所得一水合沒食子酸標準溶液的質量濃度分別為0.0、10、20、30、40、50 mg/L。

1.2 儀器

紫外分光光度計TU-1800SPC(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.3 方法

1.3.1樣品預處理將水果洗凈、晾干。取可食部分切碎，組織搗碎機勻漿，備用。

1.3.2 總多酚的提取取試樣適量(葡萄酒吸取2mL，葡萄和柿子稱取2 g勻漿，其他水果稱取5 g勻漿)，用80mL蒸餾水洗人100mL容量瓶中，至100℃沸水浴中保溫30min，取出，冷卻，定容，過濾，濾液備用。

1.3.3測定使用5mL刻度吸管吸取1.0mL濾液(若多酚含量過高，可適當稀釋)或一水合沒食子酸標準溶液，分別用刻度吸管加入FC顯色劑或FD顯色劑及7.5％碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至10 mL，混勻，室溫顯色(下同)，測定765 nm吸光度，根據稀釋倍數和從標準曲線中查出的濃度，計算樣品多酚含量。

1.3.4 處理(FC法和FD法的比較)a]顯色穩定性比較：分別吸取1mL濾液，1mLFD或FC顯色劑。加入不同量的7.5％碳酸鈉溶液于10 mL離心管。用蒸餾水定容，混勻，在765 nm下使用儀器時間掃描功能記錄顯色后吸光度隨時間的變化，觀察顯色穩定性。b)峰形和靈敏度比較：分別吸取1.0mL 5.0mg/L沒食子酸、1 mL顯色劑及2.0 mL 7.5％碳酸鈉溶液(FD法)或3.0 mL 7.5％碳酸鈉溶液(FC法)，于10mL離心管中，用蒸餾水定容，充分顯色。進行600-1 000nm波長掃描，觀察峰形。c)準確度比較：通過添加回收率比較分析2種方法的準確度。

2 結果與分析

2.1 FC法和FD法比較

2.1.1 顯色穩定性比較FD法顯色時，加0.5 mL7.5％碳酸鈉溶液。藍色絡合物生成緩慢；加2.5 mL和3mL7.5％碳酸鈉溶液均出現沉淀，特別是加3mL7.5％碳酸鈉溶液，沉淀立即出現，且多而明顯；加lmL和2 mL 7.5％碳酸鈉溶液，不僅顯色穩定、無沉淀產生，而且標準曲線有良好的線性，但加2mL7.5％碳酸鈉溶液的吸光度是加1 mL 7.5％碳酸鈉溶液時的1.29倍(表1，圖1)。因此，對于FD法，最佳的測定條件為分別吸取1 mL濾液、1 mL FD顯色劑、2mL 7.5％碳酸鈉溶液和6mL蒸餾水，于10mL離心管中混勻，室溫下屁色30～60min，測定765 nm吸光度。

FC法顯色時，加0.5mL和1.0mL 7.5％碳酸鈉溶液，反應不完全，溶液發黃，特別是加0.5 mL 7.5％碳酸鈉溶液，放置4～5 h后，溶液仍不變藍，并有較多氣泡。對于其余6種7.5％碳酸鈉溶液加入量，均顯色良好，無沉淀產生，標準曲線線性良好，但加1.0mL7.5％碳酸鈉顯色不完全，吸光度明顯偏低；對于4、5、6、7 mL等4種7.5％碳酸鈉加入量，顯色后，經過約1 h。吸光度開始逐漸減??；加2 mL和3 mL7，5％碳酸鈉，吸光度值均較高，但加3 mL穩定性更好，顯色2 h后，吸光度值基本穩定(表1，圖1)。因此，對于FC法，最佳測定條件為分別吸取l mL濾液、1mLFC顯色劑、3mL 7.5％碳酸鈉溶液和5mL蒸餾水，于10mL離心管中混勻，顯色30～60min，測定765 nln吸光度。

對于FC法，7.5％碳酸鈉溶液的加入量有較廣的選擇范圍(表1，圖1)，加入2～7 mL均不會產生沉淀，尤其是加入3 mL 7.5％碳酸鈉溶液，在顯色2h后吸光度幾乎不變，因此，測定時對標準曲線和樣品的顯色時間選擇范圍較寬，易于操作。而對于FD法。7.5％碳酸鈉溶液加入量選擇范圍較窄，僅加入1～2mL不會產生沉淀，加入量少于1 mL則顯色不完全，加入量多于2mL則出現沉淀。因此FC法比FD法實用性更強。

2.1.2 峰形和靈敏度比較從圖2可見，FC法比FD法峰形更尖、靈敏度更高。

2.1.3 準確度比較以葡萄、葡萄酒、柿、蘋果、梨、香蕉為試材進行的沒食子酸添加回收試驗顯示。FD法添加回收率普遍較FC法高，最高達到了132％，而FC法添加回收率比較穩定，為86％一110％(表2)。

上述顯色穩定性、靈敏度和準確度比較試驗結果表明，采用FC法測定水果及其制品中總多酚含量比FD法更為穩定、靈敏和準確。

2.2 FC法測定條件的優化

2.2.1 標準物質的選擇水果及其制品中多酚的測定常采用單寧酸作為標準品，但市售單寧酸并非純品，而是由一系列不同分子量的葡萄糖桔酸酯組成的混合物。不同廠家單寧酸的純度和組分不盡相同^[4.10]。對天津市化學試劑六廠(簡稱天津)和遵義市第二化工廠(簡稱遵義)生產的單寧酸進行了比較(表3)，2者顯色后吸光度值存在顯著差異，因此，不宜選用單寧酸作為總多酚含量測定的標準物質。目前，許多方法和標準均選擇一水合沒食子酸為標準物質，該物質成分單一^[11-12]。沒食子酸顯色穩定，線性良好，R²均在0.999以上(表4)，符合測定方法要求。兇此，選擇一水合沒食子酸作為FC法的標準物質。

2.2.2 顯色劑制備時回流時間的篩選顯色劑配制見本文1.1，設1、2和10 h 3種同流時間。配制好的顯色劑稀釋1倍，加入到5.0mg/L沒食子酸溶液中，顯色，測定765 nm吸光度(表5)。回流2 h和回流10 h測得的吸光度值明顯高于回流1 h，但回流2 h和回流10 h差異不顯著，為提高檢測效率，確定顯色劑配制時的回流時間為2 h。

2.2.3 顯色劑和7.5％碳酸鈉溶液加入順序的確定處理1為吸取1.0 mL沒食子酸標準溶液(2 mg/L或5mg/L)，加入5.0mL水、lmL顯色劑和3mL7.5％碳酸鈉溶液，搖勻，顯色2 h，測定765nm吸光度。處理2與處理1基本相同，但顯色劑和碳酸鈉溶液加入順序相反。從表6可見，處理1吸光度明顯高于處理2，約為后者的2.29倍(沒食子酸5 mg/L)和2.63倍(沒食子酸2 mg/L)，因此，顯色時應先加顯色劑，后加7.5％碳酸鈉溶液。

2.2.4 檢測波長的確定用5 mg/L沒食子酸及葡萄酒、葡萄、香蕉、蘋果和柿提取液，顯色2 h后進行波長掃描，圖譜形狀完全一致，且在765 nm有最大吸收(圖3)，由此確定765 nm為測定波長。

2.2.5 顯色時間的確定用5.0 mg/L沒食子酸標準溶液及葡萄酒、葡萄、蘋果和柿提取液進行時間掃描，顯色初期吸光度有較大升高，120 min后即趨于穩定，吸光度值不再有大的變化(圖4)。因此，確定顯色時間為2 h。

3 方法應用

3.1 標準曲線的線性范圍

以沒食子酸為標準物質，在0-8.0 mg/L有很好的線性(A₇₆₅0.119 1C，R²=0.998 7)，能夠滿足測定要求。

3.2 方法的精密度和準確度

以葡萄、葡萄酒、柿、蘋果、梨和香蕉為試材，進行精密度和準確度試驗，每種試材每種處理設7個平行樣。平行性試驗結果見表7，添加回收率試驗結果見表8。根據表7數據，計算出舊方法的相對標準偏差有99.9％的概率落在1.141％～4.259％之間，為此。將2個平行樣的相對偏差定為不超過6％。根據表8數據。本標準規定回收率為85％～115％。

4 結論

與FD法相比，FC法更加穩定、靈敏和準確，適于水果及其制品中總多酚含量的測定。優化后的FC法測定程序為，吸取1.0 mL樣品提取液或一水合沒食子酸標準溶液，加入5.0mL水、lmL顯色劑和3mL7.5％碳酸鈉溶液，搖勻，顯色2h，在765 nm波長下測定吸光度，根據沒食子酸標準曲線求出樣液中的總多酚含量。