番木瓜四倍體的誘導及形態學分析

摘 要：在離體培養條件下，將二倍體穗中紅番木瓜無菌試管苗莖尖浸入0.05％、0.1％、0.2％、0.4％秋水仙素水溶液中處理1、2、3、4、5 d，誘導多倍體，對照用無菌水處理2d。結果表明0.2％的秋水仙素溶液浸泡處理3 d效果最好。誘導率為36.7％。通過體細胞染色體數目檢測，變異芽為四倍體或嵌合體，四倍體染色體數目為36(2n=4x=36)。對獲得的四倍體和二倍體進行了形態及氣孔特征的比較，結果表明四倍體與二倍體植株在葉長、葉寬、葉厚、氣孔大小、氣孔密度、氣孔保衛細胞大小及葉綠體數目等方面存在明顯的差異，其中葉片厚度、氣孔密度和保衛細胞內葉綠體數目可作為鑒別四倍體與二倍體的重要性狀。

關鍵詞：番木瓜；多倍體；性狀

中圖分類號：s667.97 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2008)01-115-04

番木瓜(Carica papaya L.)又名萬壽果、木瓜、乳瓜，是番木瓜科fCaricaceae)多年生大型草本植物。自上世紀70年代以來。國內外番木瓜的研究工作大多集中在栽培和加工等方面，而育種領域的研究相對較少^[1-6]。而且在育種領域的研究中，人們多采用雜交育種和轉基因等方法，以期達到改善果實風味，提高抗寒性、抗病性，使株型矮化、果實小型化以及延長貨架壽命等目的。番木瓜株性高度雜合、雌雄異株、對病毒敏感是制約番木瓜遺傳改良的3大客觀因素^[7]特別是番木瓜的雜合特性給大面積生產和雜交育種過程中的后代選擇及性狀穩定帶來巨大的困難。使得以上除了株型矮化、果實小型化以外的育種目標均沒有獲得滿意的突破以外，在無子番木瓜新品種的選育上更是一片空白。

關于番木瓜的離體培養方面，已有莖尖(莖段)、葉片、花藥、體細胞胚培養、原生質體培養等的成功報道^[1-6]。尚未見有番木瓜多倍體研究的報道。而且，隨著木瓜蛋白酶需求量的不斷增加，種植番木瓜基地的擴大，大量采乳后的番木瓜成為理想的營養保健食品的原料：但是。在這些食品的制作工藝流程中，除去種子是一個重要環節。若能培育出無子番木瓜，不僅可簡化工藝流程，大大節約生產成本，還可使其品質得到質的提高。我們結合組織培養及秋水仙素誘導技術進行多倍體的誘導。以期獲得穩定的四倍體株系，為進行四倍體與二倍體的雜交獲得三倍體無子番木瓜奠定了基礎，對于豐富番木瓜種質資源和培育新品種具有重要價值。

1 材料和方法

1.1 材料

以穗中紅番木瓜無菌試管苗為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 四倍體的誘導 將無菌試管苗莖尖浸入0.05％、0.1％、0.2％、0.4％秋水仙素水溶液中均處理1、2、3、4、5 d，對照采用無菌水浸泡2 d，然后轉入MS+0.5mg/L 6-BA+0.05metENAA+30g/LSugar+6.5g/L Agar中培養，促使其叢生芽分化。

1.2.2 倍性鑒定采用改良去壁低滲——火焰干燥法^[8]制片，鏡檢觀察染色體數目確定植株倍性。

1.2.3 四倍體與二倍體植株形態與氣孔特征比較選取相同生長階段和環境條件下的純合四倍體和二倍體植株相同數量的葉片，用直尺測葉長、葉寬、游時間的最佳組合研究中，以0.2％秋水仙素溶液處理3 d效果好，誘導率最高(36.7％)，且純合四倍體植株的比例最大(6:5)。四倍體植株形態特征表現為葉片增厚、葉色濃綠、植株矮壯等，經體細胞染色體制片檢測，染色體數目為2n=4x=36(圖1)。將四倍體幼標卡尺測葉厚。取相同標準的10株植株進行測定，10計算其平均值。組培條件下，觀察比較四倍體和二倍體試管苗在相同培養條件下生長狀況等特征的差異。

氣孔特征觀察流程：取新鮮葉片一固定液固定1周左右→去離子水清洗幾次→0，1％1₂-KI溶液染色10～20 min→鏡檢計數。在目鏡帶測微尺的普通顯微鏡下取3個視野測氣孔長度和寬度、保衛細胞長度和寬度。取相同標準的樣品10株，每個樣品測定3枚葉片，每葉重復觀測3次，計算各指標平均值，并統計氣孔密度。利用Olympus顯微鏡鏡檢攝像。

2 結果與分析

2.1 四倍體的誘導

浸泡處理是秋水仙素對外植體作用最為直接的一種。結果表明，無菌苗浸泡在不同濃度的秋水仙素溶液中處理均能產生一定比例的變異，同時，材料的生長和分化也都在不同程度上受到抑制，甚至部分死亡(表1)。

從表1中看出在對秋水仙素處理濃度和處理苗莖尖轉入增殖培養基中，均能分化出大量四倍體無菌苗。

2.2 四倍體與二倍體植株形態特征比較

結果表明，四倍體與二倍體在植株形態上表現出明顯的差異性。二倍體植株的葉片較薄、葉柄較細；四倍體植株的葉片較厚、葉柄較粗，葉色較二倍體的相對深了一些。四倍體番木瓜葉片在形態上充分體現了器官形態的巨大性，葉片的長度、寬度和厚度均大干二倍體，其長度、寬度和厚度分別為二倍體的110.6％、113.3％、150.0％(表2)。葉片厚度經方差分析(F-ratio=41.173，P<0.05)，四倍體與二倍體葉片厚度達到極顯著差異，因此，葉片厚度可作為鑒別四倍體與二倍體的重要性狀。四倍體葉形指數變小，為二倍體的97％。

2.3 四倍體與二倍體植株氣孔特征比較

通過比較分析番木瓜四倍體保衛細胞內葉綠體數目明顯多于二倍體，約為二倍體的206，7％，保衛細胞明顯增大，長度和寬度均大于二倍體，分別為二倍體的141.0％、156.0％。氣孔大小較二倍體明顯增大。長度為二倍體的126.9％、寬度為二倍體的141.4％，而密度下降，為二倍體的59.4％(圖2，表3、4)。保衛細胞內葉綠體數目經方差分析(F-ratio=193.195，P<0.01)，四倍體與二倍體保衛細胞內葉綠體數目達到極顯著差異。氣孔密度經方差分析(F-ratio=37.868，P<0.01)，四倍體與二倍體氣孔密度達到極顯著差異，表明氣孔密度、保衛細胞內葉綠體數目是鑒別二倍體和四倍體的重要性狀。

3 討論

在本實驗進行之前，我們對番木瓜實生苗根尖進行了體細胞染色體記數，期望獲得天然多倍體，但是，在2000多粒種子的實生苗中沒有檢測到自然多倍體。對其花粉進行觀察也未發現未減數花粉的形成。同時，對番木瓜的胚乳培養也進行了探索，由于受取材的限制，對成熟種子的胚乳培養沒有成功。番木瓜根、莖、葉、胚珠、下胚軸等各種器官和組織的愈傷組織、胚狀體誘導均有成功的報道^[1-6]。雖然未見番木瓜胚乳培養的報道，但胚乳培養在楊桃、西番蓮、枇杷等果樹上獲得了胚乳植株^[9-11]。

近年來化學誘變劑與組織培養結合起來，使化學誘變成為人工誘導多倍體主要的快捷途徑。本實驗利用組織培養技術結合秋水仙素溶液誘導番木瓜多倍體，具有以下優點：一、加倍的目的明確，在組織培養條件下，反復大批量的在培養瓶中處理番木瓜試管苗莖尖，大大提高了誘導成功率。二、誘變后的植株易于進行早期的篩選、鑒定、而且篩選鑒定之后，對多倍體試管苗進行繼代增殖培養，可在短期內繁殖出大量的多倍體植株。有利于后續的研究工作的開展。三、容易控制實驗條件和重復實驗結果，不受季節等實驗條件的限制，提高工作效率。

通過秋水仙素溶液誘導結合組織培養技術，不僅成功獲得了純合的番木瓜四倍體植株，并比較了四倍體與二倍體之間的染色體及氣孔特征等方面的差異，而且篩選出了最適宜的誘導條件，為今后大規模的誘導培育番木瓜多倍體及進一步獲得無子類型提供了強有力的理論支持，具有重要的生物學意義。