扁桃ＰＧＩＰ基因的克隆及其序列分析

摘 要：以晉扁一號扁桃(Prunus dulcts Mmer.)基因組DNA為模板，用已登錄的扁桃PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)基因保守序列設計引物進行PCR擴增，得到了6個PGIP基因片段并克隆到PBS-T載體中。根據測序結果分析，町利用其中的3個片斷，分別命名為PdPGIPl(717 bp)，PdPGlie(864 bp)和PdPGIP3(796bp)，與公共數據庫中的序列相似性比較，其中PdPGIP2和PdPGIP3各包含2個外顯子和1個內含子，內含子符合GT-AG規律。其核苷酸序列分別與Genhank中登錄的3個扁桃以及桃(P.Dersica Linn.)、杏(P.arwteniaca Linn，)、美洲李(p.americana Marda)、中國李(P.salicina Lindl.)、馬哈利櫻桃(P.mahaleb Linnaeus)、苦櫻桃 (P.emarginata walp.)、梅(P.mume Sieb.)的mRNA、DNA序列顯示出極高的同源性，基本都在90％以上，其中PdPGIPl、PdPGIP2、PdPGIP3與Genbank中登錄的3個扁桃PGIP基因的同源性為92％～99％。對氨基酸序列保守性分析發現，含有多數植物PGIP抗病基因表達蛋白特有的亮氫酸重復序列。證明我們所克隆的目的片段為PGIP基因。

關鍵詞：扁桃；PGlPDNA；克??；測序

中圖分類號：S662.9 文獻標識碼：A 文章編號：1009—9980(2008)01-54-0

扁桃(Prunus dulcis Mill.)，又名巴旦杏、美國大杏仁，是薔薇科李亞科桃屬扁桃亞屬植物。扁桃流膠病、縮葉病等病害的病原是真菌，主要危害扁桃樹干、葉片、花和果實等。多聚半乳糖醛酸酶(PGpolygalacturonase)是多種病原真菌的致病因子，它分解植物多聚半乳糖醛酸，是病原真菌入侵過程中分泌的第一個細胞壁降解酶，它對植物細胞壁的降解不僅使其它細胞壁降解酶對其底物的攻擊更容易，而且為真菌的生長和發育提供了大量的糖源。但是此酶的活性被控制后，能催化寡聚糖無毒因子的形成，激活植物的防衛反應。雙子葉植物細胞壁中廣泛存在有多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalactur-onase-inhibitingprotein，PGIP)，它能與PG結合降低和抑制該酶的活性并且誘導寡聚糖的形成，因而在植物的防御反應中起著重要的作用^[1-6]

PGIP是一種特異性結合和抑制真菌內源PG活性的細胞壁結合蛋白，富含抗病基因所具有的亮氨酸重復序列。PG/P蛋白與PG專一地、可逆的結合，非競爭性地抑制病原菌PG酶的活性。減少了PG對植物細胞壁的降解，從而抑制了這些真菌病害的發生：另外PG/P在與PG的相互作用中使植物細胞壁能形成寡聚半乳糖，從而誘導植物的抗病性反應，使植物獲得系統抗病性。另有報道，PGIP還與果實的發育過程、脅迫反應、冷藏、漿果果實的病蟲害等有關。因而，PGIP基因已成為目前抗病基因工程和果實耐貯藏基因工程研究的重點。

國內外已從樹莓^[7]、蘋果^[8]、梨^[9]、杏^[10]、櫻桃^[11]、大豆^[12]、番茄^[13]、馬鈴薯^[14]等植物中克隆了PGIP基因，本研究以晉扁系列扁桃為試材，對其PGIP基因進行克隆和測序，以構建植物表達載體，為培育抗病、耐貯果樹新品種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

材料采自山西省農業科學院果樹研究所扁桃試驗同，晉扁一號扁桃幼果(黃豆粒大小)。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA的提取和檢測 5月上句采回果實，采用改良的CTAB法(參考文獻)提取基因組DNA，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，測定光密度值，確認DNA的質量后，-20℃保存備用。

1.2.2 PG/P基因的克隆根據Genebank中已登錄的3個扁桃PGIP基因保守序列，設計1對引物，由上海生工公司合成，上游引物為^[5']－ACTCTGTCAC－CTGTGACTCC-3'.下游引物為^5'-GACCACA-CAACCTGTFGTAGC-3’。以幼果基因組DNA為模板，進行PCR擴增。引物退火溫度的篩選是用梯度PCR儀。從50～60℃，每隔2℃設1個梯度。PCR反應體系及條件為：10×PCR buffer 2.0μL，dNTP(2.5mmo.L)0/5μL，模板DNA(120 ng/L)1.0 μL，引物(20 pmoF/μL)各0.5μL，TaqDNA(5 U/μL)0.2 μL，ddH₂O 15.3μL，總體積為20μL。擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸2 min。35次循環；72℃延伸5 min；4℃保存。

取PCR產物電泳確認得到目的片斷后，將PCR擴增產物連接到pBluescriptⅡKS+載體上，連接反應體系為：10xT₄ DNA連接緩沖液1μL，pBluescriptⅡKS+載體(15 ng/μL)2.0μL，PCR產物(335 ng/μL)4 μL，T，DNA(350U/μL)1μL，ddH₆O 2.0μL，16℃連接過夜。將連接產物轉化感受態大腸桿菌，挑取白色單菌落18個，LB培養基37℃恒溫振蕩培養過夜后。用堿法少量提取質粒DNA，Pst I、Xho I作雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，拍照。

1.2.3 PGIP基因序列分析對測序得到的核苷酸序列和推導的氨基酸序列分別用BLASTn進行相似性搜索，用DNASTAR軟件的MegAlign程序對克隆的。扁桃PG/P基因序列與3個扁桃PGIP基因以及桃(P.persica Linn.)、杏(P.armeniaca Linn，)、美洲李(P.americana Marsh，)、中國李(P.salicinaLindl.)、馬哈利櫻桃(P.mahdeb Linnaeus)、苦櫻桃(P.emarginata Walp，)和梅(P.mume Sieb.)的核苷酸序列進行相似性比對，并繪制序列聚類圖。

2 結果與分析

2.1 引物退火溫度的篩選

6個擴增體系在不同的退火溫度下均有產物，尤其在退火溫度為58℃時，擴增條帶較為明顯，所以我們選用退火溫度58℃進行了目的片段的PCR擴增，反應體系及條件同上。

2.2 目的片段的克隆和重組子篩選

以扁桃基因組DNA為模板，進行PCR擴增，將PER擴增產物克隆于pBluescriptⅡKS+載體，對重組克隆進行酶切鑒定(圖1.2)。

2.3 目的片段的序列分析

對有插入片段的陽性克隆3、5、9、12、13、14、17號進行測序(由上海生工公司完成)，測序結果顯示，12號為空載體，其余6個目的片斷分別為(3、5、14)717 bp，A2(9)為864 bp，13、17為796bp。

通過同源性分析可知，在我們所得到的6個長度不同的目的片段中，3、5和14號核苷酸序列相互間有5個堿基不同，同源性在99％以上，可歸為一個序列和PdPGIPl；9號為Pdt~IP2；13和17核苷酸序列相互間只有1個堿基不同。同源性也在99％以上歸為PdPGIP3。其中PdPGlP2和PdPGIP3均由2個外顯子和1個內含子(陰影部分)構成，PdPGIP2實際長度為864 bp，包含2個外顯子(一個外顯子大小為360 bp，另一個外顯子大小為357 bp)和1個內含子(內含子大小為147 bp)，內含子兩端具有真核生物典型的GT-AG拼接點序列特征(圖3)。PdPGIP3實際長度為796bp，同樣包含2個外顯子(一個外顯子大小為359 bp，另一個外顯子大小為357 bp)和1個內含子(內含子大小為80 bp)，內含子核苷酸序列也符合GT-AG特征(圖4)。另外，在PdPGIP2去除內含子后，其大小和PdPGlPl相同。

2.4 扁桃PGIP基因的核酸分析

我們得到的片段測序后其核苷酸序列分別與Genbank中登錄的3個扁桃PGIP基因以及桃、杏、美洲李、中國李、馬哈利櫻桃、苦櫻桃、梅的mRNA、DNA序列顯示出極高的同源性，基本都在90％上(表1)。其中PdPGIPl與Genbank中登錄的3個扁桃PG，IP基因的同源性分別為95％、98％、99％；PdPGIP2分別為93％、95％、96％；PdPGIP3為92％、92％、96％。

由序列聚類圖(圖5)來看，來自同一種的PGIP基因序列的并不都表現出較高的同源性，而與另一種的同源性相對較高。PdPGIPl與已登錄的2個扁桃的同源性很高，與GenBank上已登錄的扁桃的AFl96925基因同源性達到99％，可認為與此是同一基因，不作為一個新基因對待；PdPC，IP3則與美洲李登錄的2個基因同源性比較高；PdPGIP2分離出來，表現出與其它品種種間同源性相對較低的特點。

2.5 推測氨基酸序列保守性分析

根據得到的堿基序列推測的氨基酸序列均具有含24個殘基長的亮氨酸重復序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX，PdPGIPl f圖6)和PdPGIP3(圖8)含有2個這樣的序列，PdPGIP'2(圖7)只含有一個。這種亮氨酸重復序列是多數植物PGIP抗病基因表達蛋白特有的保守序列。

3 討論

扁桃屬于干果類，果實食用部分為果仁，而不是果肉。對PGIP基因的研究最初始于其對果實成熟的影響，因此，對果樹PGIP的研究以前多集中于果實以果肉為食用部分的果樹，而對象扁桃這樣不以果肉作為食用部分的果樹研究較少。目前。關于扁桃PGIP基因的研究報道、僅限于Genbank中登錄的幾個扁桃PGIP基因，進一步的研究尚未進行。

眾多研究表明不同的植物種類具有多樣性的PGIP，對于不同真菌的PG，這些PGIP具有不同的特性，植物表達的不僅僅是一種PGIP，可能是來自一個物種的至少2個接近物種的相關PGIP基因拷貝編碼。例如有報道在菜豆(Phsaeaus vulgaris)中，不同的條件下有4種PGIP表達。其中，PvPGIPI基因在植物受傷后表達，PvPgip3基因由寡聚半乳糖醛酸刺激誘導其表達，而PvPGIP2在創傷、真菌侵染、寡聚半乳糖醛酸和水楊酸誘導下都可以表達，PvPGIP4則在任何條件下都不表達。研究結果發現，前3種PGIP基因的啟動子中都含有一個或幾個W-boxes，可以激發誘導信號^[1.5]。進一步的研究確定扁桃果實中的PGIP的活性是否有助于其產物的表達，并把PGIP的活性與扁桃的特定基因聯系起來。另外，不同品種間PG/P基因與不同真菌PGs相互作用的能力不同^[1]。現在已在1種菜豆(Phsaeolusvulgaris cv.pinto)的cDNA文庫中發現并分離到PGIP基因的2個成員(PGIPl和PGIP21。它們在編碼區內只有26個核苷酸的差異。本研究從扁桃中克隆到的PGIP基因，其抑菌種類及抑菌效果如何，還需要進一步的研究和探討。

4 結論

用生物信息學的方法分析扁桃PG/P基因序列，采用PROSITE數據庫和SMART服務器對其編碼的氨基酸序列進行氨基酸分析：利用ClustalW(http：//www.ebi.ac.uk.clustalw.#)程序將該基因和其它植物的PGIP基因進行序列的同源性比較和進化樹分析等。與公共數據庫中的序列相似性比較，其中較長的2個片段中各包含2個外顯子和1個內含子，內含子符合GT-AG規律。其核苷酸序列分別與Genbank中登錄的扁桃、杏、美洲李、中國李、馬哈利櫻桃、苦櫻桃、梅的mRNA、DNA序列顯示出極高的同源性。其中PdPGIPl、PdPGIP2、PdPGIP3與Gen-bank中登錄的3個扁桃PGIP基因的同源性為99％～92％。對氨基酸序列保守性分析發現，其含有多數植物PGlP抗病基因表達蛋白特有的亮氨酸重復序列。除PdPGlPl作為一個新基因證據不足外，其它2個可證明我們所克隆的目的片斷為PGIP基因。