菠蘿非胚性愈傷組織的類型及其器官發(fā)生

摘 要：以菠蘿lAnanas comasus (L)Merr.非胚性愈傷組織為材料，利用離體培養(yǎng)及組織細(xì)胞學(xué)等方法研究了其在增殖、分化過程中的特性和再生規(guī)律。在增殖培養(yǎng)基上經(jīng)過3次以上繼代培養(yǎng)后，非胚性愈傷組織形態(tài)上逐漸表現(xiàn)出一定差異。根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、分化能力和組織細(xì)胞學(xué)特征，可把非胚性愈傷組織分為節(jié)瘤狀組織、薄壁組織團(tuán)、致密深層愈傷組織和表面疏松愈傷組織4種類型；在增殖培養(yǎng)基Ms+3.0m/LBA+2.0m/LNAA上，一種類型的非胚性愈傷組織通常只會生長出同類型的非胚性愈傷組織，但通過改變培養(yǎng)基配方等方法可使不同類型之間發(fā)生轉(zhuǎn)換。同時(shí)，增殖繼代過程中的器官發(fā)生現(xiàn)象很常見，通常是在薄壁愈傷組織表面細(xì)胞分化成具有分生能力的細(xì)胞，然后進(jìn)行不定芽的分化。4類非胚性愈傷組織都可以通過擬原球莖、多芽體以及不定芽的形式進(jìn)行器官發(fā)生；也可以經(jīng)胚性誘導(dǎo)由體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生成植株。其中擬原球莖產(chǎn)生體細(xì)胞胚的能力最強(qiáng)，多芽體其次。生長素及細(xì)胞分裂素對非胚性愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分化途徑以及增殖能力有很大的影響。

關(guān)鍵詞：菠蘿；非胚性愈傷組織；類型；形態(tài)發(fā)生

中圖分類號：S668-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009—9980(2008)Ol一65一04

菠蘿離體培養(yǎng)中所產(chǎn)生的愈傷組織有2類。一類愈傷組織的細(xì)胞大而高度液泡化的細(xì)胞，這類細(xì)胞分化能力較弱，一般不具備胚胎發(fā)生潛力，需經(jīng)2代以上誘導(dǎo)后方能向胚性愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化或進(jìn)入器官(不定芽、不定根)再生途徑；另一類愈傷組織是由成簇成團(tuán)的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞組成，這類細(xì)胞具有成胚能力，因而，將這類愈傷組織又稱為胚性愈傷組織。菠蘿外植體脫分化所形成初始愈傷組織通常是非胚性愈傷組織。雖然其非胚性愈傷組織在特定條件下可通過定向誘導(dǎo)而成為胚性愈傷組織，再通過體細(xì)胞胚發(fā)生完成植株再生^[1]，但在通常條件下。外植體脫分化形成愈傷組織后都是經(jīng)器官發(fā)生途徑來完成植株的再生。迄今為止，國內(nèi)外對菠蘿離體培養(yǎng)進(jìn)行了較多研究^[2-3]。但對其非胚性愈傷組織的類型和器官發(fā)生等研究還未見報(bào)道。我們對菠蘿非胚性愈傷組織的類型及離體器官發(fā)生進(jìn)行了組織細(xì)胞學(xué)觀察，旨在探索非胚性愈傷組織在增殖和分化過程中組織細(xì)胞學(xué)變化規(guī)律，為進(jìn)一步調(diào)控愈傷組織培養(yǎng)再生途徑和提高體細(xì)胞胚誘導(dǎo)效率提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1 材料

供試菠蘿品種為神灣(Ananas cv.Shen-wan)，采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果園。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和分化培養(yǎng)按照何業(yè)華等^[1]的方法，取菠蘿吸芽在MS+2.0 mg/LBA+2.5md/L NAA上誘導(dǎo)愈傷組織，切下該愈傷組織轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基MS+3.0meCLBA+2.0 mg/LNAA上增殖，每30d進(jìn)行1次繼代培養(yǎng)。

將不同類型非胚性愈傷組織切成約3 minx3 mmx3mm大小的小塊分別接種于含NAA(0、0.1、0.5、1、2、3、5、7 mg/L)與BA(0、0.1、0.5、1、2、3、4、5、7 mg/L)不同質(zhì)量濃度組合的培養(yǎng)基上，每瓶接種8塊，設(shè)5個(gè)重復(fù)，30 d后統(tǒng)計(jì)觀察擬原球莖、多芽體及不定芽的分化情況。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察將不同類型非胚性愈傷組織浸于FAA中固定24 h，按常規(guī)石蠟切片法制片，用蘇木精整染^[1]。切片在BH02 OLYMPUS雙簡顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 非胚性愈傷組織類型及外觀特征

非胚性愈傷組織于增殖培養(yǎng)基上經(jīng)過3次以上繼代培養(yǎng)后，其形態(tài)上逐漸表現(xiàn)出一定差異。經(jīng)過4 a共48代培養(yǎng)觀察及結(jié)合細(xì)胞學(xué)的證據(jù)，按照非胚性愈傷組織的生長部位、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分化能力及胚性獲得能力，可將其分為節(jié)瘤狀組織(Globular andNodular Smcture，圖版一a1、不規(guī)則薄壁組織團(tuán)(Parenchyma Clumps，圖版-b)、表面疏松愈傷組織fSurface Loose Calhs，圖版-c)及致密深層愈傷組織(CompaetInteriorCallus，圖版一d)等4種類型。節(jié)瘤狀組織外表深褐色，組織結(jié)構(gòu)緊密；不規(guī)則薄壁組織團(tuán)表面白色，但表面還常有一些老化的褐色組織斑點(diǎn)；表面疏松愈傷組織外表淺綠色，表層密集疏松突出物：致密深層愈傷組織是以上3類愈傷組織靠近培養(yǎng)基的部分，色深而堅(jiān)硬。

2.2 愈傷組織的器官發(fā)生類型及其細(xì)胞學(xué)特征

4種類型非胚性愈傷組織都可以通過不定芽(Adventitious shoots，圖版-el、e2)、擬原球莖(又稱類原球莖，pmtocorm-like bodies/PLBs，圖版-fl、f2)、多芽體(Multiple Buds，圖版-gl、g2)等器官發(fā)生途徑-再生。

薄壁組織團(tuán)(圖版A)由較大的類似皮層細(xì)胞構(gòu)成，含色素少或無，液泡大，輸導(dǎo)組織豐富，在中高質(zhì)量濃度(3-5 mg/L)BA培養(yǎng)基(含2～3 mg/L NAA)上誘導(dǎo)及增殖較快，分化能力較低，培養(yǎng)2-3代后開-始產(chǎn)生不定芽，再繼代培養(yǎng)4代以上后會轉(zhuǎn)為多芽體。節(jié)瘤狀組織是由細(xì)胞壁次生增厚的類似木質(zhì)部細(xì)胞組成(圖版C、D)。含輸導(dǎo)組織相對較少，比薄壁組織容易發(fā)生分化，它在中高濃度(3—5 mg/L)BA培養(yǎng)基(含2-3 mg/L NAA)上培養(yǎng)l代即有不定芽產(chǎn)生，3～4代后基本上都會成為多芽體，在含2，4～D的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上較容易獲得體細(xì)胞胚。表面疏松愈傷組織則在中高質(zhì)量濃度(3～5 mg/L)BA培養(yǎng)基(含2～3 mdLNAA)中很容易分化出不定芽和發(fā)展成多芽體。致密深層愈傷組織通常需先增殖出新的愈傷組織后才再分化出不定芽，直至成為多芽體。

非胚性愈傷組織在增殖培養(yǎng)1～3代后也會部-分發(fā)生器官分化。根據(jù)3種器官發(fā)生途徑之間的相互關(guān)系可將非胚性愈傷組織器官發(fā)生過程分為2種，一種是在其表面零星分化產(chǎn)生的一些不定芽(圖版E、F)，再轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(MS+BA0，5 rag／L+NAA0.1 mg/L)上繼續(xù)培養(yǎng)3-4代后常轉(zhuǎn)為多芽體；另一種在其表面分化出擬原球莖，再通過擬原球莖形式進(jìn)行植株再生，繼續(xù)轉(zhuǎn)移至再分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4代后也會轉(zhuǎn)為多芽體。

多芽體呈花椰菜狀，發(fā)生后期是由蓮座狀的葉狀體或不定芽基部愈合而形成，其基部為肉質(zhì)白色薄壁細(xì)胞，由于薄壁細(xì)胞生長快速，內(nèi)多含有較大空隙，頂部的芽原基非常不規(guī)則(圖版B)。在減少或去除BA以后，芽原基進(jìn)一步發(fā)育成不定芽。一般在培養(yǎng)20 d以后，多芽體開始形成莖部融合的葉狀體，薄壁組織則易形成單個(gè)莖不明顯的不定芽。

在增殖培養(yǎng)過程中4類非胚性愈傷組織都會產(chǎn)生擬原球莖，其擬原球莖形成率(形成擬原球莖的愈傷組織塊數(shù)占全部供試愈傷組織塊數(shù)的百分比)在40％以上，而在MS+1.0 mg/L BA+3.0 mg/L NAA上則達(dá)98％。擬原球莖大小均一、卵圓形，增殖快，但器官發(fā)生能力最低：有些在發(fā)生后期具有單極的突出的芽，并能繼而發(fā)育成植株。依生長素種類和濃度不同，擬原球莖呈黃綠至綠色(在含少量2，4-D培-養(yǎng)基上色澤偏黃)，形態(tài)和解剖學(xué)上類似于體細(xì)胞胚(圖版G)，但是在基本培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)往往缺少根的形成，不能萌發(fā)成完整植株，而在MS+1.0 mg/LBA+3.0 m/L NAA的非胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上非常容易愈傷化而失去分化能力。已形成的擬原球莖以及愈傷組織表面部分是擬原球莖發(fā)生旺盛部位，擬原球莖的增殖能力不僅與培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組成有關(guān)，且與培養(yǎng)時(shí)間、接種密度、與培養(yǎng)基的接觸情況、周圍組織的生長情況有關(guān)。通過在NAA(0、0.1、0.5、1、2、3、5、7 mg/L)與BA(0、0.1、0.5、1、2、3、4、5、7 mg/L)不同質(zhì)量濃度組合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表明，擬原球莖的增殖系數(shù)可以從0到17.54，且較少依賴于培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組成，如果擬原球莖增殖到一定密度，增殖將降低或停止。

在愈傷組織增殖繼代過程中。一種類型的非胚性愈傷組織通常只會生長出同類型的非胚性愈傷組織。但通過改變培養(yǎng)基配方等方法一種類型的非胚性愈傷組織可產(chǎn)生出另一類型的愈傷組織。同時(shí)。繼代過程中的器官發(fā)生現(xiàn)象非常普遍。通常是在薄壁愈傷組織表面細(xì)胞分化成具有分生能力的細(xì)胞，然后進(jìn)行不定芽的分化。擬原球莖和多芽體更容易進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生。

2.3 非胚性愈傷繼代培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量濃度對愈傷組織增殖及分化的影響

非胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)中，生長素及細(xì)胞分裂素對愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分化途徑以及增殖能力有很大的影響。總的來說，當(dāng)培養(yǎng)基中NAA質(zhì)量濃度較高(≥3 mg/L)和BA質(zhì)量濃度低f<0.5 mg/L)時(shí)，愈傷組織生長慢、褐化，不定芽大而散生，不定根發(fā)生頻率增高；當(dāng)NAA濃度穩(wěn)定在2～3mg/L時(shí)，BA質(zhì)量濃度升高(3～7 mg/L)則同時(shí)利于白色薄壁組織及多芽體形成(表1)，不定芽基部愈合，葉呈蓮座狀在薄壁組織頂端環(huán)繞；加入少量2，4-D(0.5～1m/L)可促進(jìn)擬原球莖的發(fā)生，愈傷組織變黃而疏松，不定芽葉也變窄。

3 討論

愈傷組織有胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，它們在生理生化和發(fā)育上都有明顯差異，直接關(guān)系到其植株的再生，一定條件下相互之間還可以轉(zhuǎn)變^[4]。本研究中，菠蘿非胚性愈傷組織的增殖非常容易，在一系列質(zhì)量濃度的生長素fNAA、IAA、2.4-D1和細(xì)胞分裂素(BA)組合培養(yǎng)基中可得到良好的愈傷組織生長狀況和增殖量。NAA濃度較高f≥3 mg/L)和BA質(zhì)量濃度低(<0.5 mg/L)，不利于愈傷組織和多芽體的生長，利于不定根發(fā)生；BA濃度升高(≥3 m/L)則同時(shí)利于白色薄壁組織及多芽體形成。在菠蘿愈傷組織增殖培養(yǎng)基繼代過程中，不同類型的非胚性愈傷組織在分化的同時(shí)，通常只會增殖出同類型的非胚性愈傷組織，但分化出的擬原球莖和多芽體更容易進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生^[1]。

有研究者在菠蘿離體培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞分裂素結(jié)合一定質(zhì)量濃度的生長素(如NAA)，會生成“塊狀”組織以及擬原球莖，或者愈傷組織月，器官發(fā)生一般會經(jīng)過節(jié)瘤狀組織^[6]。原球莖是蘭科植物的一種再生方式，它最初是指蘭花種子萌發(fā)過程中的形態(tài)學(xué)構(gòu)造，在蘭科植物離體培養(yǎng)中，擬原球莖多與體細(xì)胞胚發(fā)生密切相關(guān)。主要體現(xiàn)在體細(xì)胞胚發(fā)育后期通過擬原球莖形式進(jìn)行植株再生^[7-8]。擬原球莖的細(xì)胞學(xué)起源上還存在爭議^[9]。現(xiàn)在較為普遍接受的觀點(diǎn)是，擬原球莖屬于多細(xì)胞起源，而且只有單極性，因此在離體培養(yǎng)中與體細(xì)胞胚相區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)所觀察到的擬原球莖具有與蘭科植物擬原球莖類似的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征，而且在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中能高頻地轉(zhuǎn)化為胚性愈傷組織。多芽體是由類似皮層上的薄壁細(xì)胞以及形態(tài)學(xué)上端的不規(guī)則分生組織構(gòu)成，這類有高度增殖能力的已分化組織也具有較高的胚性潛能㈣。

在通過愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生的研究中，對初始愈傷組織形態(tài)、增殖分化情況、胚性誘導(dǎo)能力的描述及研究還很少見。前人的研究已揭示，外植體敏感性的不同可以解釋它們對誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應(yīng)差異^[11]。植物種間、基因型間、甚至相同外植體的不同細(xì)胞間的敏感性都有差異，從而胚性獲得能力也有所不同^[12]。菠蘿的非胚性愈傷組織雖然屬于未分化細(xì)胞，但仍然顯示出一定的細(xì)胞類型和形態(tài)學(xué)特征。通過增殖，能夠保持原代細(xì)胞的各種性質(zhì)，包括胚性誘導(dǎo)能力。在實(shí)際操作中，挑選利于誘導(dǎo)的組織(擬原球莖、多芽體)進(jìn)行增殖有利于獲得更多的胚性組織誘導(dǎo)效率。

4 結(jié)論

菠蘿的非胚性愈傷組織可分為節(jié)瘤狀組織、不規(guī)則薄壁組織團(tuán)、表面疏松愈傷組織及致密深層愈傷組織等4個(gè)類型。它們都可以通過不定芽、擬原球莖、多芽體等器官發(fā)生途徑完成植株再生：也可以經(jīng)胚性誘導(dǎo)由體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生成植株，其中擬原球莖和多芽體更容易進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生。在增殖繼代過程中。一種類型的非胚性愈傷組織通常只會生長出同類型的非胚性愈傷組織，但通過改變培養(yǎng)基配方等方法可使不同類型之間發(fā)生轉(zhuǎn)換，同時(shí)，器官發(fā)生現(xiàn)象常見。生長素及細(xì)胞分裂素對非胚性愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分化途徑以及增殖能力有很大的影響。4類非胚性愈傷組織在發(fā)生器官分化中，是先形成不定芽、擬原球莖，若繼續(xù)將培養(yǎng)物在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4代后則成為多芽體，并會大大加快不定芽增殖速度。(本文圖版見封3)