ＳＳＲ標(biāo)記及其在葡萄上的應(yīng)用

摘 要：SSR(simple sequence repeat)作為第2代基于PCR的一種新型DNA分子遺傳標(biāo)記，數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、分布于整個(gè)基因組、特異位點(diǎn)擴(kuò)增、發(fā)生頻率高、共顯性遺傳。對(duì)SSR引物開發(fā)，SSR標(biāo)記在葡萄品種別、系譜重建、遺傳圖譜構(gòu)建、商業(yè)品種保護(hù)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并指出了未來的研究方向。

關(guān)鍵詞：葡萄；SSR標(biāo)記；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2008)0l-93-09

重復(fù)序列DNa(epetirive sequences DNA)包括衛(wèi)星DNA(satetellite DNA)、小衛(wèi)星fminisatellitel和微衛(wèi)星(mierosatellite。simple sequence repeat，SSR)3類，其中微衛(wèi)星重復(fù)度最低。典型的微衛(wèi)星序列一般是由5～100個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列單元構(gòu)成，重復(fù)單元含1-6個(gè)堿基[如(GA)。，(GATA)nJ。真核生物中，估計(jì)有10g~105個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)隨機(jī)分布于整個(gè)基因組中，這些豐富的微衛(wèi)星序列可以組成無數(shù)的多態(tài)性位點(diǎn)，從而作為遺傳標(biāo)記加以利用^[1-3]。

微衛(wèi)星起初只是作為探針，用于真核生物基因組的RFLPfRestrietion Fragment Length P0lvmot-phisml研究。PCR(polymerase chajn reaction)技術(shù)建立以來，SSR標(biāo)記以其數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、分布于整個(gè)基因組、特異位點(diǎn)擴(kuò)增、發(fā)生頻率高、共顯性遺傳等特性已廣泛應(yīng)用于品種鑒別、種質(zhì)資源管理、遺傳圖譜和系譜構(gòu)建以及品種保護(hù)等方面。隨著SSR標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，它在葡萄方面也有大量利用的報(bào)道。本文綜述SSR標(biāo)記的發(fā)展，及其在葡萄方面的應(yīng)用進(jìn)展。

1 SSR標(biāo)記的發(fā)展

1.1 葡萄屬基因組SSR標(biāo)記的發(fā)展

Thoma8等^[4]首先研究了SSR標(biāo)記在葡萄品種鑒別上的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列在葡萄中廣泛存在，可以為歐亞種葡萄品種(vitis vinifera L.)鑒別提供大量信息，而且SSR位點(diǎn)可用于葡萄屬不同種的研究，通過系譜分析發(fā)現(xiàn)ssR標(biāo)記為共顯性遺傳。因此，sSR標(biāo)記適合用來構(gòu)建遺傳圖譜和遺傳關(guān)系的分析研究^[5]。不僅如此，SSR標(biāo)記跨種(cross-species)、跨屬fcross-genera)的可轉(zhuǎn)移性“ransferability)也很強(qiáng)^[4.6-10]。

隨著葡萄SSR標(biāo)記研究的發(fā)展，一些研究小組相繼開發(fā)了SSR引物^[6.11-12]。SSR標(biāo)記的鑒定及建立成本高而且費(fèi)時(shí)，其過程包括葡萄基因組文庫(kù)的構(gòu)建、利用微衛(wèi)星探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選、含有微衛(wèi)星克隆的測(cè)序、利用微衛(wèi)星側(cè)翼序列設(shè)計(jì)SSR引物、優(yōu)化SSR-PCR反應(yīng)條件、分析擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。采用上述方法，幾個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了大約190多對(duì)SSR引物^[5-6.8-12]。然而，葡萄的科學(xué)研究。特別是葡萄屬基因組作圖研究需要大量的SSR標(biāo)記，葡萄微衛(wèi)星協(xié)會(huì)(Vitis Microsatellite Consomum，VMC)于1997應(yīng)運(yùn)而生。這個(gè)國(guó)際性協(xié)會(huì)由1家私有公司fAgrogene，F(xiàn)rancel和不同國(guó)家的21個(gè)研究型實(shí)驗(yàn)室構(gòu)成，文獻(xiàn)[7，9，13]發(fā)表的引物有57對(duì)。利用基因組文庫(kù)的微衛(wèi)星序列，VMC已經(jīng)開發(fā)了360多對(duì)新的SSR標(biāo)記引物，引物序列可以在希臘葡萄數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得(Greek Vitis database.http：//gvd.biology.uoc.gr/gvd/；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

1.2 基于EST(Expressed Sequence Tag)的SSR標(biāo)記

隨著功能基因組研究的深入，積累了大量的基因組DNA序列數(shù)據(jù)和EST數(shù)據(jù)。通過計(jì)算機(jī)分析可發(fā)現(xiàn)大量SSR的存在。公共數(shù)據(jù)庫(kù)(如EMBL、GenBank、DDBJ)作為微衛(wèi)星位點(diǎn)的來源，廣泛應(yīng)用于生物微衛(wèi)星的研究，如馬鈴薯^[14]、高梁^[15]、大豆^[16]等。隨著cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和EST數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展。EST-SSR標(biāo)記已在水稻^[17]、葡萄^[18]、白菜^[19]等作物上有成功的報(bào)道。利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)快速而簡(jiǎn)便，可以獲得多種重復(fù)類型和單元，獲得的SSR引物序列高度保守，多態(tài)性稍低，但這些標(biāo)記在近緣物種中具有更大的轉(zhuǎn)移性，即從一個(gè)物種中開發(fā)的SSR引物，可能在其它物種中也適用。此外，從EST數(shù)據(jù)庫(kù)中開發(fā)的SSR出現(xiàn)在基因豐富的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，可直接對(duì)基因作圖。

從已經(jīng)構(gòu)建的葡萄EST文庫(kù)中可以篩選大量的SSR標(biāo)記^[20-22]。Scott等^[18]和Decroocq等^[23]分析了葡萄的EST數(shù)據(jù)，并篩選了SSR標(biāo)記，鑒定出的SSR引物可用于葡萄屬不同種、品種(包括砧木品種)的鑒別，同時(shí)研究了這些引物在近緣屬植物上應(yīng)用的可轉(zhuǎn)移性，如白粉藤屬(Cissuss)、烏蘞莓屬(Cayrati-a)、蛇葡萄屬(Ampelopsis)、爬山虎屬(Parthenocissus)、酸蘞藤屬(Ampellocissus)。

1.3 基于cpDNA的SSR標(biāo)記

葉綠體微衛(wèi)星(Chlomplast SSR，cpSSR)是近年來發(fā)展起來的一種新型高效的分子標(biāo)記技術(shù)。作為植物體內(nèi)三大遺傳系統(tǒng)之一，葉綠體基因組與核基因組nuclearDNA，nDNA)相比，具有下列特點(diǎn)：(1)分子量小、多拷貝、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；多為閉環(huán)雙鏈DNA，大小為120～210 kb；(2)原核性，序列相當(dāng)保守，其進(jìn)化速率緩慢，僅為nDNA的1/5；(3)cpDNA的保守性并非絕對(duì)，非編碼區(qū)比編碼區(qū)有更高的可變性，而且在較多植物類群中都有不同程度的種內(nèi)變異；(4)單親遺傳。如一些裸子植物為父系遺傳^[24]，大多數(shù)被子植物為母系遺傳^[25]，不參加基兇重組(即不受選擇壓力)，且不受基因的重疊、缺失及假基因的干擾，有獨(dú)立的進(jìn)化路線。這些特點(diǎn)決定了cpSSR在植物種一級(jí)分類單位上進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化學(xué)研究具有更大優(yōu)勢(shì)。

Weising等^[26]利用煙草開發(fā)了10對(duì)epSSR引物，并在茄科Solanaceae)、獼猴桃科(Actintdiaceae)、十字花科Brassicaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、薔薇科俾asaceoe)、禾本科(eooceo~)和龍舌蘭科似(Aa\\gavace)等科植物上進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)這10對(duì)引物的通用性很強(qiáng)。

2 SSR標(biāo)記在葡萄上的應(yīng)用

2.1 品種鑒定

葡萄屬(V.genus)是葡萄科(Vitaceae)中經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的一個(gè)屬，由約70個(gè)可以相互雜交的種組成，廣泛分布于北半球，其中的歐亞種葡萄(V.vinifera)廣泛應(yīng)用于葡萄酒工業(yè)。葡萄品種數(shù)量龐大，幾乎每一個(gè)葡萄生產(chǎn)國(guó)都有自己的葡萄品種圃。其無性繁殖特性有利于在世界各地傳播，很多品種僅憑形態(tài)學(xué)特征很難區(qū)分，有些品種在傳播過程中被易名，同物異名(如西拉在法國(guó)稱為Syrah。在澳大利亞稱為Shiraz)和同名異物的現(xiàn)象比較普遍，無性系品種、體細(xì)胞突變、嵌合體及葡萄品種的多克隆起源都使品種的鑒別更加困難。因此，正確鑒別葡萄品種對(duì)品種資源管理、利用、保護(hù)和葡萄酒國(guó)際貿(mào)易具有重要意義。同時(shí)，葡萄屬內(nèi)各個(gè)種親緣關(guān)系的鑒定，對(duì)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究具有重要意義。

Thomas等^[4]首先報(bào)道了利用SSR標(biāo)記鑒定26個(gè)歐亞種葡萄品種和6個(gè)葡萄屬的其它種，其中包括圓葉葡萄(V，rotundifolia或Muscadiniarotundifolia)，然后又?jǐn)U大到80多個(gè)葡萄基因型(包括砧術(shù)品種、釀酒葡萄、鮮食葡萄和制干葡萄)的鑒定^[5]。結(jié)果表明，SSR標(biāo)記可以正確地鑒定葡萄種、種間雜交品種和純種品種。Bowers等^[11]對(duì)76個(gè)葡萄品種的鑒定結(jié)果表明，除了幾組品種外(黑比諾fPinot Noir)，白比諾[Pinot Blanc]，灰比諾[Pknot Gris]和Meunier；Keshmesh和湯姆遜無核IThompson Seedlessl；Dattier，RhazakiArhanon和Markandil。其它品種都具有獨(dú)特的SSR帶型。因此，DNA分子標(biāo)記可以作為鑒定品種的附加的描述符^[27]。目前，(澳大利亞)聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織fCommonwealth Scientific and Industrial Re。search Organization，CSIRO)建立了約200個(gè)葡萄基因型的SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。來自于7個(gè)國(guó)家的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，以33個(gè)主要釀酒、鮮食、制干和砧木品種為對(duì)照品種，選取6個(gè)多態(tài)性信息量(polymorphism infor，marion content。PIC大的SSR引物進(jìn)行研究，通過控制不同實(shí)驗(yàn)室的反應(yīng)條件，并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化編碼處理。初步建立了46個(gè)葡萄品種的SSR位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。這項(xiàng)研究為國(guó)際葡萄品種數(shù)據(jù)庫(kù)的建立奠定了基礎(chǔ)礎(chǔ)(http：//，www.genres.de/eccdb/vitis/)。希臘、保加利亞也建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)fbttp：//gvd.biology，uoc.gr/gvd/；http：//bukenom.abi.bg)。

對(duì)47個(gè)葡萄栽培品種和19砧木品種的SSR分析結(jié)果表明，栽培品種的基因多樣性性(gene diversi-ty，GD)值為0.52～0.87，而砧木品種的GD值為0.70～0.91；在樹狀圖上，砧木品種和栽培品種可以明顯的區(qū)分^[20-30]。某些品種從名字上推測(cè)可能有共同起源，但SSR聚類結(jié)果并非如此，因此不能單憑系統(tǒng)發(fā)育樹判定品種的親緣關(guān)系^[9]。某些情形下，全同胞后代常常與親本之一聚為一類^[29]。SSR位點(diǎn)與其側(cè)翼區(qū)DNA序列分析能夠提供種內(nèi)或種間有關(guān)系統(tǒng)發(fā)育更正確的信息，對(duì)SSR位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)DNA序列突變聚類分析結(jié)果表明，爬山虎屬植物(Parthenocissusauinquefolia)與葡萄屬的9個(gè)種明顯不同，歐洲種葡萄與美洲葡萄(V.1abrusca).V.ttrmola.V.arizonica聚為一組，山葡萄(V.ollluresis)、沙地葡萄(V. rupestris)、河岸葡萄(V.riparia)、伯蘭氏葡萄(V.berlandieri)和園葉葡萄(V.rotuntifolia)聚為一組^[7]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，等位基因的變異不僅表現(xiàn)存SSR重復(fù)數(shù)目上，還表現(xiàn)在重復(fù)區(qū)內(nèi)不同類型的‘中斷’(interruption)，以及重復(fù)單元側(cè)翼區(qū)核苷酸替換、插入/缺失上。因此，DNA長(zhǎng)度相同的等位基因包括同源等位基因和由趨同進(jìn)化引發(fā)的異源等位基因(homoplasy)。

以基于EST獲得的10對(duì)SSR引物對(duì)葡萄屬不同種f包括種間雜種)，以及白粉藤屬、烏蘞莓屬植物進(jìn)行研究，這些引物在不同水平(品種、種、屬)上都表現(xiàn)明顯的多態(tài)性，來自于3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’UTR)的引物在品種水平上多態(tài)性最強(qiáng)，5’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(5’UTR)的引物在品種間和種間水平上多態(tài)性最強(qiáng)，來自于編碼區(qū)內(nèi)的SSR引物在種間和屬間的多態(tài)性最強(qiáng)，說明基于EST的SSR引物可以應(yīng)用于不同分類水平、生態(tài)學(xué)、保護(hù)學(xué)和群體學(xué)研究^{[18-23.31-32]}。

利用SSR位點(diǎn)，通過對(duì)葡萄同物異名(syn，onyms)、同名異物(homonymous)品種以及系譜的鑒別?？梢杂行У毓芾砥咸逊N質(zhì)資源^[9.33-34]，同時(shí)也是一種鑒定特殊產(chǎn)區(qū)葡萄酒質(zhì)量的工具^[35]。對(duì)不同地理起源164個(gè)葡萄品種(Greece、Croatia、North Italy，Austria、Germany、France、Spain、Portugal)的SSR分析結(jié)果表明，觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity，Ho)為0.776-0.904，總的期望雜合度(expected hetemzy，gosity.He)為0.71～0.85；聚類分析表明。66％的品種能夠歸于來源群體，同時(shí)確認(rèn)了增芳德fZinfandel)的起源^[36]。PeHerone等^[5]對(duì)意大利南部17個(gè)葡萄品種的SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析，基因多樣性值為0.31～0.79，利用引物VVMD7可以區(qū)分65％的供試品種，單位點(diǎn)區(qū)分力(discrimination power)為0.4～0.9。同時(shí)，SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)還可以闡明品種間的親緣關(guān)系^{[6.9.29-30.33.41]}如來源于希臘的品種與克羅地亞品種親緣較近，而與來源于土爾其的品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)^[42]。

SSR標(biāo)記帶型容易判讀，等位基因大小以堿基對(duì)表示。葡萄是以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主的植物，除了體細(xì)胞突變，同一品種的不同個(gè)體在遺傳上是一致的。一般說來，從一個(gè)個(gè)體上獲得的SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，除了體細(xì)胞突變外，可以代表這個(gè)品種的特性。SSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)，不同實(shí)驗(yàn)室、葡萄不同發(fā)育時(shí)期的研究結(jié)果可比性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，利用自動(dòng)測(cè)序儀和專門的數(shù)據(jù)收集軟件可以實(shí)現(xiàn)SSR分析的自動(dòng)化^[5.43]。不同年份、不同實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果證明了SSR位點(diǎn)的可重復(fù)性^{[27-28.43-44]}，但由于PCR過程中的打滑(stutter)和Taq酶的額外堿基滲入，不同實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果會(huì)有一些差異^[27-28]。

SSR標(biāo)記在區(qū)分葡萄品種方面顯示了巨大的潛力。理論上，5個(gè)不連鎖的位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)帶有5個(gè)頻率相等的等位基因。就可以產(chǎn)生超過700 000個(gè)基因型^[11]。實(shí)際上，這種理想情況非常罕見，為了使區(qū)分和鑒別品種所需要的標(biāo)記數(shù)量最小，一定要篩選信息量大的SSR位點(diǎn)，因?yàn)椴煌琒SR位點(diǎn)提供的信息量和區(qū)分力不同^{[6.27.34.40.41.45]}。

2.2 同物異名和同名異物品種的鑒別

對(duì)大量的葡萄品種資源進(jìn)行管理時(shí)，常常會(huì)遇到品種的同物異名和同名異物現(xiàn)象，當(dāng)要以最小的資源保存數(shù)量代表最大的遺傳變異時(shí)，這2類品種的鑒別顯得非常重要。采用SSR標(biāo)記可以鑒定同物異名或同名異物品種^{[10.33-34.38.40-41]}。而且采用形態(tài)學(xué)或RAPD標(biāo)記已經(jīng)被鑒定為同物異名或同名異物的品種，可以被SSR標(biāo)記進(jìn)一步證實(shí)^{[9.11.33.35.37.43.46-49]}。

Thomas等^[3]首先發(fā)現(xiàn)了葡萄砧木品種5A Teleki和5BBKober在7個(gè)SSR位點(diǎn)上完全一致，有可能為同物異名品種；Keshmesh和湯姆遜無核、Dallier和Rhazaki Arhanon、湯姆遜無核和蘇丹尼娜fsultan-ina)為同物異名品種叫^[11.50]；意大利(nalia)和白玫瑰香(Muscat 0f Alexandrial可能為同物異名品種[411；Monastel和Monastrell名下的幾個(gè)品種為同名異物品種_蚓。法國(guó)和意大利西北部一些葡萄品種為同物異名，表明這些品種有共同的起源^[47]。另一種情況是。假定為同物異名的品種可以被SSR分析結(jié)果區(qū)分^{[34.40.45.51]}如克羅地亞品種Hrvatica被認(rèn)為與意大利品種Croatina是同一個(gè)品種，SSR分析結(jié)果表明，2者為異物異名^[37]。

另一方面，親緣關(guān)系非常近的品種，也有可能被認(rèn)為是同物異名。如從表現(xiàn)型很難區(qū)分桑嬌維賽(SangiOVeSe)的自交后代，但其基因型不同；24個(gè)后代中12個(gè)表現(xiàn)型相似，而且與母本桑嬌維賽相似；其余12個(gè)個(gè)體表現(xiàn)型各異，與母本也不同嘲。10個(gè)SSR位點(diǎn)分析結(jié)果表明，只有2個(gè)個(gè)體基因型相同而表現(xiàn)型不同^[52]。說明有必要采用更多的SSR標(biāo)記或AFLP標(biāo)記來檢測(cè)其基因型的差異。

2.3 無性系和體細(xì)胞突變體的鑒別

葡萄無性系間的差異可能是由病毒、外界誘導(dǎo)的遺傳差異(epigenetic difference)、體細(xì)胞突變(so—marie mutationl，以及3者共同作用引起。因?yàn)閚SSR檢測(cè)的是基因組的非編碼區(qū)，而無性系或體細(xì)胞突變品種常發(fā)生在基因組的編碼區(qū)，或者突變位點(diǎn)位于SSR分析位點(diǎn)之外。因此，采用SSR標(biāo)記鑒定葡萄無性系(如果色無性系)、體細(xì)胞突變體和嵌合體有一定困難^{[9.27.29-30.33-.53]}。如比諾系品種^[11.46]、玫瑰香系fMuscats)品種^[38]、桑嬌維賽系品種^[4.54]，以及芽變品種與母體品種的檢測(cè)^[50]。單克隆起源(monoelonal origin)品種的檢測(cè)容易，多克隆起源(polyclonal origin)品種的檢測(cè)難^[39.54-56]。但隨著SSR引物的開發(fā)，無性系品種的檢測(cè)會(huì)變的可能^[57]，特別是零等位基因(1 a1-leles)更有助于無性系品種的鑒別^[38]。

為了鑒定無性系或體細(xì)胞突變品種，有必要采取多種分子結(jié)合來進(jìn)行研究^[58]。如利用ISSR(Inter-simple sequence repeall標(biāo)記不能鑒定Garnacha品種的無性系^[59]，而AFLP(Amplifiedfragmentlengthpo1y－morphisml標(biāo)記就可以為無性系品種的鑒定提供有益的幫助^[49.60-63]。

2.4 系譜重建

現(xiàn)存的很多葡萄品種已經(jīng)有幾百年的歷史，其產(chǎn)生過程包括野生類型經(jīng)過人工栽培的長(zhǎng)期馴化、野生葡萄和栽培品種的自然雜交、栽培品種間雜交及自交。葡萄品種作為一種農(nóng)作物或者文化遺產(chǎn)，研究其遺傳發(fā)生及現(xiàn)今分布具有重要意義。最初用來雜交的古老野生葡萄已經(jīng)不復(fù)存在，但一些本身就是品種的親本可能還在栽培或作為資源保存。利用分子標(biāo)記分析法，可以識(shí)別這些親本品種和后代，進(jìn)而重新構(gòu)建品種的親緣關(guān)系系譜。SSR標(biāo)記為共顯性遺傳?？梢钥朔っ?、RAPD等標(biāo)記在系譜研究上的局限性^[64-65]。用SSR標(biāo)記構(gòu)建的譜系關(guān)系，還可以利用cpSSR標(biāo)記進(jìn)一步確認(rèn)父母本。

葡萄系譜研究最令人驚奇的結(jié)果就是赤霞珠(Cabernet Sauvignon)起源的發(fā)現(xiàn)^[66]。該品種是世界著名釀酒品種，從17世紀(jì)開始在法國(guó)栽培，在形態(tài)上與另一個(gè)法國(guó)品種品麗珠(Cabernet Franc)極為相似。通過比較歐洲中部葡萄品種的SSR帶型，認(rèn)為品麗珠和長(zhǎng)相思(Sauvignon Blancl是赤霞珠的雙親，驚奇之處在于長(zhǎng)相思為白色釀酒品種。Sefc等^[67]進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)研究結(jié)果，同時(shí)給出了Neuburger、Blauburger、Zweigelt和米勒～圖高(Mttller-Thurgau)的親本，特別是米勒一圖高親本的確認(rèn)。因?yàn)槿藗円恢睉岩善錇槔姿玖?Riesling)x西萬尼(Sflvaner)的后代，或雷司令的自交后代。Thomas等^[5]首先證明了米勒一圖高不是雷司令×西萬尼的后代。進(jìn)一步研究證明，米勒一圖高是雷司令Chasselas de Courtilller的后代。對(duì)法國(guó)葡萄品種的進(jìn)一步研究表明，16個(gè)法國(guó)東北部品種的親本是一樣的，同為比諾(Pinot)和Gouais Blanc的雜交后代，這16個(gè)品種中不乏著名的釀酒品種，如霞多麗(Chardonnavl、黑佳美fGamayNoir)、阿里戈特(Aligot6)、麥籠(Melon)和Auxerrois^[]，根據(jù)Gouais Blanc和比諾的起源和歷史分布。推測(cè)這些品種分別來源于不同的時(shí)期和地點(diǎn)，而后引入法國(guó)的；根據(jù)這些品種的果皮顏色，認(rèn)為黑比諾最有可能是其親本，上述結(jié)果對(duì)葡萄核心種質(zhì)構(gòu)建(corecoUecfion)以及雜種優(yōu)勢(shì)(heterosis)利用具有重要的指導(dǎo)意義，因?yàn)镚ouaisBlanc本身品質(zhì)一般。但其作為雜交親本的遺傳潛力卻很大。

通過比較中歐葡萄品種的SSR標(biāo)記，Sefc等^[]構(gòu)建了親緣關(guān)系很近的9個(gè)葡萄品種的復(fù)雜系譜，證明西萬尼為瓊瑤漿(TramJner)和Osterreichisch WeiB的雜交后代，否定了其來源于野生葡萄的假設(shè)；Neuburger為西萬尼和Roter Veltliner的雜交后代，而非白比諾和西萬尼的自然雜交種。Cres，pan^[70]利用同工酶(GPI和PGM)和SSRfnSSR和cpSSRl標(biāo)記證實(shí)了玫瑰香fMuscat of Hamburg)為Schiava Gmssax白玫瑰香的后代。

根據(jù)SSR標(biāo)記和24個(gè)形態(tài)性狀的觀測(cè)結(jié)果，克羅地亞最重要的白色釀酒品種Posip的親本也被闡明呻。此外，阿爾卑斯葡萄(alpine grapel品種Lafnetscha和Comalin du Valais：^[72-73]、比諾^[74]、玫瑰香系品種^[38]等的系譜也被闡明。

2.5 遺傳圖譜構(gòu)建

SSR作為以PCR為基礎(chǔ)的第2代分子遺傳標(biāo)記，是構(gòu)建高密度分子遺傳圖譜的有效工具。遺傳圖譜的構(gòu)建不僅可以用來檢測(cè)控制重要經(jīng)濟(jì)性狀表達(dá)的位點(diǎn)，而且有助于利用圖譜對(duì)相關(guān)基因克隆。

Riaz等^[75]以雷司令×赤霞珠F₁群體為試材，利用核nSSR和EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建了雙親的連鎖圖和整合圖(consensus map)，整合圖由20個(gè)連鎖組構(gòu)成，長(zhǎng)度為1728 cM，標(biāo)記在3張圖上對(duì)應(yīng)連鎖組上的排列順序基本一致。因?yàn)槔姿玖詈统嘞贾槭轻勗彀?、紅葡萄酒的著名品種，而且赤霞珠葡萄被國(guó)際葡萄基因組計(jì)劃(International Grape Genome Program.IG.GP.http：//www.vitaeeae.org)選為合作構(gòu)建物理圖譜fplTysicalmap)的對(duì)象品種。因此，該圖作為參考圖已經(jīng)被IGGP采用，其后不久，Adam-Blondon等^[76]以西拉和歌海娜(Grenache)正反交F₁群體和雷司令的自交群體為試材，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了3個(gè)品種的連鎖圖和整合圖，這4張圖各由19個(gè)連鎖組構(gòu)成，與葡萄基因組fn=19)染色體數(shù)一致，整合圖長(zhǎng)1406.1cM，標(biāo)記問平均距離6.4 cM，標(biāo)記在4張圖上對(duì)應(yīng)連鎖組上的排列順序基本一致。與Riaz構(gòu)建的連鎖圖相比，Adam-Blondon又將123個(gè)新的SSR標(biāo)記定位到各個(gè)連鎖組上，大多數(shù)連鎖組上標(biāo)記排列順序與Riaz的結(jié)果一致。這個(gè)圖譜作為Riaz構(gòu)建的圖譜的補(bǔ)充，可將分散性好的標(biāo)記轉(zhuǎn)移到其它圖譜上，用于OTLQuantitative trait locus)的檢測(cè)。

在構(gòu)建葡萄遺傳圖譜的基礎(chǔ)上開展控制重要性狀的基因或QTL的定位分析，為進(jìn)一步進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，甚至克隆這些基因或QTL打下基礎(chǔ)。Doligez等^[77]以歐洲種葡萄種內(nèi)雜交后代為試材，利用SSR、AFLP、RAPD(Random ampJified polymorphicDNA)、SCAR(Sequence characterized amplified re—gions)、同工酶和1個(gè)形態(tài)學(xué)標(biāo)記(果皮顏色1構(gòu)建Ir雙親的連鎖圖和整合圖，整合圖包括20個(gè)連鎖組、總長(zhǎng)1002 cM.將果皮顏色性狀定位到父本連鎖圖和整合圖的第3連鎖組上，并檢測(cè)到了與元核性狀(seedlessnessl和漿果質(zhì)量fberry weight)的QTL，但QTL附近主要是AFLP和SCAR標(biāo)記。葡萄的產(chǎn)量與每株果穗數(shù)、穗重、每穗漿果數(shù)和漿果質(zhì)量密切相關(guān)，F(xiàn)anizza等^[78]利用SSR和AFLP標(biāo)記檢測(cè)了歐洲種鮮食葡萄(意大利xBig Perlenl與產(chǎn)量構(gòu)成性狀有關(guān)的QTL。

由歐洲種葡萄開發(fā)的SSR引物已經(jīng)成功地應(yīng)用于北美種葡萄fNorth American Vitis species)和東亞種葡萄(Asian Vitis species)D，7，29]，這些研究結(jié)果為利用SSR標(biāo)記構(gòu)建葡萄屬內(nèi)不同種的遺傳圖譜提供了可能。Dalbom等^[79]利用RAPD、CAPSfCleavedamplified polymorphic sequences)、AFLP和SSR標(biāo)記構(gòu)建了Horizon fSeyval x Schuyler，2品種來源于V.vinifera.V.labrusca.V.sestiualia和V.nwestris的雜交后代)和Illinois 547-1(V，rupestris×V.cinema )的遺傳圖，圖譜長(zhǎng)分別為1199 cM和1470 cM，利用16個(gè)SSR和2個(gè)CAPS標(biāo)記確定了10個(gè)同源連鎖組，并將控制葡萄花型的基因定位到Illinois第14連鎖組上，與1個(gè)SSR標(biāo)記fVVS3)連鎖。Grando等^[80]以V.vinifera cv.Moscato biam'o x V，raria Fl群體為試材，利用SSR和AFLP標(biāo)記構(gòu)建了遺傳圖，利用符合3：1分離的標(biāo)記確定了14個(gè)同源連鎖組，SSR標(biāo)記在連鎖組上的排列順序與Doligez等^[77]和Dalbom：D1的研究結(jié)果基本一致，定位到y(tǒng)，riparia上的SSR標(biāo)記同樣被定位到歐洲種葡萄上，說明SSR標(biāo)記不僅可以在不同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)，而且不同種葡萄的遺傳圖可以利用SSR標(biāo)記整合。為抗性基因定位和QTL檢測(cè)提供基礎(chǔ)。Doucleff等^[81]利用SSR、RAPD、ISSRfInter-short sequence repeatsl、AFLP標(biāo)記構(gòu)建了V.rupestris和V.arizonica的遺傳圖，利用181個(gè)3：1分離的標(biāo)記將父母本的遺傳圖聯(lián)結(jié)起來，該圖譜為抗病基因作圖、克隆和檢測(cè)抗線蟲、抗細(xì)菌性皮爾斯病fPierce’s disease)的QTL提供有益的信息。

白粉病(powdery mildew)和霜霉病(downy wildew)是葡萄生產(chǎn)上的2種重要病害，絕大多數(shù)歐洲種葡萄品種不抗這2種真菌性病害，為了提高抗病性，主要采用優(yōu)良的歐洲種葡萄品種與抗病的美洲種葡萄fNorth American Vitis species)進(jìn)行多重雜交。因?yàn)槟承┲匾慕?jīng)濟(jì)性狀為數(shù)量性狀，因此葡萄育種很難控制。Fischer等朗以RegentO／，aestivalis.V.berlandieri，V.cinerea，V.1abrusca，V.1incecumii.V.卻aria和V.rupestris的多重雜交后代1×Lemberger(V.viniferr-a)F₁群體為試材，利用SSR、SCAR、AFLP和RAPD標(biāo)記構(gòu)建了雙親的連鎖圖，利用共顯性標(biāo)記和3：1分離標(biāo)記構(gòu)建了包括12個(gè)同源連鎖組的整合圖?？拱追鄄〉腝TL位于Regent第16連鎖組，耐霜霉病的2個(gè)QTL分別位于Regent第9、10連鎖組，據(jù)此推斷抗霜霉病基因位于2條不同的染色體上。此外，還鑒定了與漿果成熟、漿果大小、副梢生長(zhǎng)(axillaryshoot growth)相關(guān)的QTL，漿果顏色和6個(gè)功能基因標(biāo)記，如GD(glutamate dehydrogenase)、UFGT(UDP-glucose：flavonoid 3-0-glUCOSyltransferase)、AD(alcoholdehydrogenase)等，分別被定位到雙親的連鎖組上。UFGT作為花青素生物合成過程中的最后一個(gè)酶，與果實(shí)顏色分列于不同的連鎖組。

抗白粉病性狀為單顯性基因Runl(resistancetoUncinula nec~on控制，該基因存在于圓葉葡萄中，而歐洲種葡萄不攜帶有該基因^[83-84]。以圓葉葡萄和歐洲種葡萄的BC5群體為材料，已經(jīng)獲得了與Runl基因連鎖的分子標(biāo)記^[85]，利用這些分子標(biāo)記和細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BACl文庫(kù)，構(gòu)建了Runl基因的遺傳圖譜和物理圖譜，發(fā)現(xiàn)了20個(gè)新的分子標(biāo)記(基于BAC末端序列1與Runl基因緊密連鎖，Runl位于VMC4f3.1和CB292.294之間，這個(gè)區(qū)域含有2個(gè)由RGA(resistance gene ana-10gues)構(gòu)成的多基因家族^[84]。

2.6 葉綠體SSR標(biāo)記 Arroyo-Garcia等^[86]利用Weising等閉開發(fā)的10對(duì)cpSSR通用引物對(duì)葡萄屬植物(V.vinifera.V.berlarMieri.V.riparia，V.mpestris及種問雜種)進(jìn)行擴(kuò)增，其中3個(gè)引物(cpSSR3、cpSSR5和epSSRl0)擴(kuò)增的7個(gè)cpSSR位點(diǎn)在92個(gè)歐洲種葡萄品種(39個(gè)來自于希臘，53個(gè)來自于西班牙)上表現(xiàn)多態(tài)性，其Ha分別為0.49、0.49和0.61，并證明了cpSSR為母性遺傳，cpSSR的遺傳特點(diǎn)可以為葡萄品種父母本的確定提供依據(jù)。通過cpSSR分析發(fā)現(xiàn)，赤霞珠的母本為品麗珠，玫瑰香的母本為Schiava Grossa^[70]。

Grassi等^[87]利用cpSSR3、cpSSRl0分析了意大利12個(gè)歐洲葡萄栽培種品種(V.Vinifera ssp，sativa)和12份野生種(V.vinifera ssp.silvestris)類型，2對(duì)引物分別擴(kuò)增出2個(gè)和3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，據(jù)此將供試樣品分為5種單元型(haplotype)。cpSSR標(biāo)記還可以用來檢測(cè)和鑒定葡萄汁和葡萄酒的生產(chǎn)品種^[88]。此外，cpSSR標(biāo)記在研究葡萄科葡萄屬的近緣屬間系統(tǒng)發(fā)育方面也能提供有用的信息^[89]。

2.7 葡萄育種者權(quán)利保護(hù)

DNA分子標(biāo)記作為葡萄商業(yè)品種的注冊(cè)和保護(hù)正發(fā)揮越來越大的作用。新品種的保護(hù)可以采用專利(Patenl)或植物育種者權(quán)利(Plam BreedersRights，PBR)的方式而得到保護(hù)，專利的應(yīng)用范圍較廣，不僅限于特殊的品種，而植物育種者權(quán)利是專門針對(duì)植物品種的。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(Inter—national Union for the Protection of New Varieties 0fPlants，UPOV)工作組正在研究利用DNA分子標(biāo)記鑒定品種和植物育種者權(quán)利保護(hù)。最近，4個(gè)新的澳大利亞釀酒葡萄品種(Cienna，Vermilion，Rubienne，Tyrian)已被同意進(jìn)行植物育種者權(quán)利保護(hù)，品種注冊(cè)的內(nèi)容中包括了SSR標(biāo)記位點(diǎn)^[90]。歐盟EuropeanUnionl已對(duì)葡萄品種的用途進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，可以預(yù)料。SSR標(biāo)記將在葡萄新品種鑒定及保護(hù)、葡萄酒品質(zhì)鑒定、葡萄產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易等方面發(fā)揮越來越重要的作用。

3 結(jié)論和展望

SSR標(biāo)記在葡萄品種鑒別、揭示和區(qū)分同名異物和同物異名、系譜關(guān)系確認(rèn)和遺傳圖譜構(gòu)建等方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，這種分子標(biāo)記將和其它類型的標(biāo)記一起解決葡萄遺傳和生產(chǎn)領(lǐng)域的一系列問題，如等基因系(isogenlelines)和突變品種的鑒別、嫁接苗砧木品種的鑒定、發(fā)酵前葡萄汁及葡萄酒生產(chǎn)品種的鑒別等。

我國(guó)野生葡萄資源豐富，變異類型多樣，是葡萄抗性育種的寶貴種質(zhì)資源，如山葡萄的抗寒性、刺葡萄(V.davidii)和毛葡萄(V. heyneana)的抗病性。如何利用和保護(hù)這些寶貴的種質(zhì)資源，以及在葡萄栽培釀酒過程中保證品種純度和葡萄酒質(zhì)量，SSR分子標(biāo)記可以提供有益的信息。今后，可以從以下幾方面開展相應(yīng)研究：(1)構(gòu)建葡萄屬(科)植物的系統(tǒng)發(fā)育樹；(2)建立我國(guó)葡萄資源指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)；(3)通過種間雜交、突變體篩選，定位和克隆我國(guó)葡萄資源的抗性和品質(zhì)基因，以及雜交優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)；(4)葡萄育種者權(quán)利保護(hù)和葡萄酒市場(chǎng)的監(jiān)督管理。