熒光定量ＰＣＲ技術(shù)聯(lián)合檢測乙肝病毒ＤＮＡ及ＹＭＤＤ變異的臨床應(yīng)用

摘 要 目的：采用熒光定量PCR技術(shù)對慢性乙肝患者用拉米夫定治療1年后，患者血清中HBV DNA水平變化及YMDD基因變異的檢測，并對其臨床應(yīng)用進行評價。方法：選取82例乙肝患者經(jīng)拉米夫定治療1年前、后其血清采用熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測HBV DNA及YMDD變異，回顧性對YMDD野生型組和YMDD變異型組進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果：拉米夫定治療前HBVDNA的載量，兩組相比差異沒有統(tǒng)計學意義，1年后YMDD的變異率為15．86%，YMDD變異型組HBV DNA無1例陰轉(zhuǎn)，YMDD野生型組HBV DNA陰轉(zhuǎn)率為82．60 %，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測HBV DNA及YMDD變異具有很好的臨床應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 熒光定量PCR 聯(lián)合檢測 拉米夫定 HBVDNAYMDD變異

材料與方法

2006年6月～2008年4月用拉米夫定抗HBV治療的慢性乙型肝炎患者82例，治療時間≥1年，年齡14～62歲（平均35．1±3．8歲），男58例，女24例。

采清晨空腹靜脈血4ml，不添加抗凝劑，分離血清，于-20℃保存，不反復凍融。標本、對照品的處理和加樣血清標本、試劑盒內(nèi)陽性對照、陰性對照、YVDD對照各取50μl，分別加入50μl核酸提取液，振蕩10秒，99℃干浴或水浴10分鐘，13000rpm離心10分鐘，保留上清備用。處理后的樣品應(yīng)在3小時內(nèi)使用，或在-200～-800℃最長保存1個月，HBV DNA標準品進行10、100、1000倍梯度稀釋。

取（N+1）×36μl混合液A與（N+1）×0．4μl酶（Taq+UNG）混勻（N為反應(yīng)管數(shù)），3000rpm離心數(shù)秒；?。∟+1）×36μl混合液 B與（N+1）×0．4μl酶（Taq+UNG）混勻，3000rpm離心數(shù)秒；

分別取上述加酶后的混合液A和混合液B各36．4μl置于不同兩個薄壁PCR反應(yīng)管中，然后將樣品、陽性對照、陰性對照、YVDD對照、YIDD對照處理上清液和梯度稀釋的HBV DNA標準品各4μl分別加入PCR反應(yīng)管中置于Line-Gene FQD-33A熒光定量PCR檢測系統(tǒng)上。

循環(huán)條件設(shè)置：37℃×2分鐘；94℃×2分鐘；再按93℃×15秒→62℃×60秒，循環(huán)40次；熒光檢測在62℃熒光通道選擇FAM，立即進行擴增反應(yīng)。

YMDD變異檢測：HBVYMDD弱陽性對照混合液A和混合液B的熒光檢測Ct值均應(yīng)≤38，HBVYVDD血清對照、HBVYIDD血清對照混合液A檢測所得Ct值應(yīng)≤38，混合液B檢測為陰性，否則試驗視為無效。

根據(jù)工作曲線計算，儀器自動顯示待檢樣品DNA定量值。待檢樣品混合液A和混合液B的熒光檢測Ct值≤38，判斷待檢樣品為HBVYMDD野生型，。

待檢樣品在混合液A檢測Ct值≤38，混合液B檢測為陰性，判斷待檢樣品為HBVYMDD變異型，如圖1。

如果檢測Ct值在38～40之間，重復檢測1次，如果檢測Ct值仍在38～40之間，則判為陰性。

結(jié) 果

82例患者血清中13例發(fā)生變異，占15．86%，變異類型與年齡和性別無明顯相關(guān)性。將結(jié)果分為YMDD野生型組和YMDD變異型組，回顧性分析兩組治療前的HBVDNA拷貝數(shù)（取對數(shù)值）差異無統(tǒng)計學意義（t=0．521，P>0．05）

拉米夫定用藥12個月后，其YMDD 變異型組與YMDD野生型組相比，HBV DNA陰轉(zhuǎn)率明顯不同，<5．0×102拷貝數(shù)/ml（對數(shù)值為2．69）為陰性，結(jié)果顯示：變異后HBV DNA含量反跳，無1例陰轉(zhuǎn)。而野生型在用藥12個月后，HBV DNA陰轉(zhuǎn)率明顯增加，陰轉(zhuǎn)率達82．60%，二者的HBVDNA拷貝數(shù)（取對數(shù)值）經(jīng)統(tǒng)計，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義（t=24．9，P<0．01）。

討 論

拉米夫定具有強力地抑制乙肝病毒復制的作用，可迅速降低患者血清HBV DNA水平。該作用主要是通過抑制HBV多聚酶活性，阻斷HBV DNA合成而實現(xiàn)的。拉米夫定為胞嘧啶核苷類似物，在體內(nèi)以三磷酸化形式與HBV多聚酶結(jié)合后，競爭性抑制了多聚酶活性，造成HBV DNA鏈合成終止，從而抑制病毒復制。位于多聚酶活性結(jié)構(gòu)區(qū)域Ｃ的YMDD基因序列是其結(jié)合位點，編碼多聚酶的Ｐ基因的個別核苷酸的變異可改變該結(jié)合位點的構(gòu)象，使HBV可逃避拉米夫定的作用而產(chǎn)生耐藥株。

目前檢測YMDD變異的分子生物學方法主要有直接測序法、限制性片斷多態(tài)性分析（RFLP）^[2]、5'-核酸酶檢測法、基因芯片法、熒光定量PCR熔解曲線法、焦磷酸測序技術(shù)、高效變性液相色譜法等。測序法是目前專家共認的金標準，但需配置測序儀，一次性投入資金較大，測序周期較長，費用較高；PCR-ELISA在進行PCR擴增后，需要預雜交、雜交、顯色等開放性試驗，容易造成標本的交叉污染以及影響實驗室的質(zhì)量控制操作繁瑣，費時，不適合當天出檢測報告；基因芯片需要開放式雜交，會造成一定的交叉污染需要配置芯片儀，一次性投入資金較大，且芯片成本較高，這些方法對技術(shù)和設(shè)備要求很高或者操作繁瑣，耗時費力，不利于大范圍的普及與推廣。

參考文獻

1 中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病分會、肝病分會.病毒性肝炎防治方案.中華肝臟病雜志，2000，8:324-329.

2 Sun J，Hou J L，Xiao L，et al.Analysis of three lamivudine resistant HBV mutants with the method of restriction enzyme digestion and its application.Zhonghua Shi Yan he Lin Chang Bing Du Xue Za Zhi，2003，17(1):18-20.