羊骨髓間充質干細胞體外培養生長及誘導分化特性的觀察

061000河北省滄州市人民醫院骨三科

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摘 要 目的：對羊骨髓間充質干細胞加以誘導分化，并分析其作為組織工程瓣膜種子細胞的可行性，探討體外培養羊骨髓間充質干細胞（BMSCs）和一般細胞生物學的特性。方法：采用成年山羊10只，麻醉后分別于股骨大轉子穿刺抽取羊骨髓標本10ml，采用比重為1.07g/ml的淋巴分離液，接種于無菌的培養瓶中，利用多孔培養板，取第二、三代骨髓間充質干細胞，加入LG-DMEM條件培養基進行體外定向誘導分化。對誘導后培養的骨髓基質的間充質干細胞（MSCs）進行細胞生長測定及形態觀察。結果：培養后的骨髓間充質干細胞和血管間質細胞形態相似，呈梭形或多角型，均24小時內貼壁，3～4天鋪滿瓶底。誘導分化后的骨髓間充質干細胞與血管間質細胞上清液羥脯氨酸含量基本相似，且生長曲線也相同。培養的MSCs粘附貼壁呈紡錘狀，并有多個突起，潛伏期一般為24小時，接種后第8天MSCs生長逐漸緩慢，進入平臺期。結論：誘導分化后所培養的間充質干細胞，具有獨特的增殖和表型特征，是合適的組織工程瓣膜間質種子細胞。

關鍵詞 誘導分化 組織工程 羊骨髓間充質干細胞 體外培養

資料與方法

一般資料：本組實驗采用成年山羊10只。主要試劑為水合氯醛、安定、粉劑DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、淋巴分離液、多聚甲醛（PFA）、免疫組化學試劑盒等。 主要儀器包括細胞培瓶、24孔細胞培養板、1ml凍存管、超凈工作臺、離心機、CO2培養箱、倒置相差顯微鏡、振蕩器等。

實驗方法：①把成年山羊麻醉后，固定四肢，術區剃毛，常規消毒鋪巾。分別于股骨大轉子穿刺抽取肝素化骨髓10ml，稀釋、離心、棄上清及脂肪層，其余細胞用LG-DMEM無血清培養基重懸，鋪于等體積的Percoll淋巴細胞分離液上，離心收集單個核細胞，消化傳代培養。取第二、三代骨髓間充質干細胞，加入LG-DMEM條件培養基進行體外定向誘導分化。對誘導后的細胞進行形態觀察、免疫組化鑒定并繪制生長曲線。上述10只山羊抽取骨髓后，無菌條件下取大隱靜脈，剝去靜脈外膜，剪成1～3mm，貼壁法培養，消化傳代。取第3代骨髓間充質干細胞與血管間質細胞，分別以5×104L密度接種于24孔培養板，常規孵育96小時。每孔各吸取培養基0.5ml，測定兩種細胞上清液中的羥脯氨酸含量。完畢后用胰蛋白酶消化對處于數生長期的細胞加入凍存液，調整細胞密度為7×109/L置于液氮中，1周后復蘇，計算兩種細胞的存活率。反復種植3次，每兩次間隔24小時，第4天各組均取出2份樣本，掃描電鏡觀察。第7天向其余標本中加入四唑鹽，采用酶聯免疫檢測儀490nm處骨髓間充質干細胞組、血管間質細胞組的吸光度值，比較兩種細胞在去細胞主動脈瓣上的生長能力。②羊骨髓間充質干細胞（BMSCs）的生長曲線測定：將細胞懸液接種于24孔培養板上，每孔1ml，每天取貼壁細胞的計數，連續8天計算均值，描繪細胞傳代后生長曲線。③羊骨髓間充質干細胞的凍存：取生長期的羊BMSCs細胞（凍存前全量換液），用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集，加入等量的凍存液，吹打均勻，以1ml/支移入無菌凍存管密封在-20℃，2小時后，移至零下80℃深低溫冰箱中凍存8～10小時，然后移入-196℃的液氮中。④凍存羊骨髓間充質干細胞（BMSCs）的復蘇。取出凍存管后，迅速投入加有37℃溫水的燒杯中移入超凈操作臺，然后將融化的細胞懸液移入離心管，加入完全培養液10～15ml，吹打均勻，加入完全培養基以1×10⁵個/ml接種于50ml培養瓶中，24小時后全量換液1次，以后常規培養。

統計學方法：統計學軟件采用SPSS10.0，計數資料用X²檢驗。

結 果

培養的骨髓間充質干細胞黏附貼壁，均呈紡錘狀，并有多個突起。一般細胞接種密度下的骨髓間充質干細胞，三代細胞生長周期基本一致，均為接種培養后第2～3天，但生長較緩慢，為生長遲滯期。3 天后細胞生長有快速增長過程，達到對數生長期，在7～8天時，細胞總數達到最高值，為生長平臺期，其后生長速度逐漸減緩。免疫細胞化學染色后，顯示所培養細胞的細胞膜抗原CD44均呈陽性。羊骨髓間充質干細胞的特征，是原代細胞在培養瓶底散在分布，呈圓形，胞體透亮，折光性好，很多的骨髓造血細胞混雜在內。在第9天換液后，懸浮細胞基本祛除，瓶底聚集生長的細胞形態多不規則，15天可見多處聚集生長的細胞群脫落，中心細胞為梭形，可見多個突起。根據生長情況每4～7天進行1次傳代，傳代細胞接種后 2～4 小時即迅速貼壁、伸展，6～10 小時左右活細胞基本完成貼壁。傳代細胞的生長較原代較快，接種后7天即可鋪滿整個培養瓶底，凍存復蘇的活細胞率大約為95.6%。羊骨髓間充質干細胞的生長曲線測定表明，其三代細胞生長周期基本一致，接種培養后，開始生長較緩慢，為生長遲滯期；3天后細胞生長加速，達到對數生長期；7～8天細胞數達最高值，為生長平臺期，其后生長速度減緩。光鏡下觀察顯示免疫細胞化學染色后的細胞膜抗原CD44有陽性表達。

討 論

本組實驗結果顯示，經過傳代后即可得到純度較高的羊骨髓間充質干細胞（BMSCs），所培養細胞的干細胞生長曲線也基本一致，這說明培養的細胞不是骨髓中的造血干細胞，來源應為同一干細胞，因為所培養細胞的細胞膜抗原CD44陽性。綜上所述，本組實驗結果證實了所培養的細胞是處于未分化階段的骨髓間充質干細胞，具有較強的遺傳穩定性和增值能力，可隨凍隨取，適于建立種子細胞庫，是作為骨組織工程種子細胞的合適選擇。

參考文獻

1 顧春虎，王云雅，李亮，等.誘導分化羊骨髓間充質干細胞作為組織工程瓣膜間質種子細胞的可行性.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(20).

2 曹希武，苗軍.羊骨髓間充質干細胞的體外培養及臨床鑒定分析.中國社區醫師，2008，10(9):11.