浮游植物葉綠素a測定方法的改進

廈門市環境監測中心站 姜欣欣

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浮游植物葉綠素a測定方法的改進

廈門市環境監測中心站 姜欣欣

對分光光度法測定浮游植物葉綠素a的規范方法進行改進，利用丙酮加熱過程提高了丙酮的萃取能力，并對丙酮浸漬提取時間進行了探討，證明改進法更能有效地提取葉綠素a，并且該方法更為簡便、容易操作，可以適用于葉綠素a的常規監測。

葉綠素a 測定方法 改進

在環境監測中，葉綠素a是表征浮游植物生物量的重要指標之一。通過測定浮游植物葉綠素，可掌握水體初級生產力情況，反映水體富營化程度。通常對淡水中葉綠素a的測定方法是采用《水和廢水監測分析方法（第四版）》[1]，即下面所用的規范方法。該方法實驗提取過程操作略顯繁瑣，樣品在分析過程中多次轉移，易造成樣品的缺失，影響測定結果。在不影響丙酮萃取分光光度法原理的前提下，本文對規范法進行了改進，利用丙酮加熱以提高萃取能力，并對若干個湖泊、湖庫、河流水進行了對比實驗。

1 實驗部分

1.1 材料

微囊藻（），由實驗室提純培養，處于對數生長期。

1.2 主要儀器

過濾裝置、抽濾瓶、真空泵、研缽、冰箱、乙酸纖維濾膜（孔徑0.45μm）、離心機、722型分光光度計、具塞刻度離心管（10mL）、電熱恒溫水浴鍋。

1.3 試劑

90%丙酮、碳酸鎂粉末。

1.4 實驗方法

1.4.1規范法

1.4.1.1水樣濃縮。在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜，在50kPa左右的負壓下抽濾定量體積的水樣。將抽濾完得到的濾膜，放入冰箱低溫干燥6~8h。

1.4.1.2樣品提取。取出干燥后的濾膜放入研缽，加入少量碳酸鎂粉末和2~3mL90%丙酮，充分研磨提取葉綠素a。用離心機4000r/min離心20min。將上清液轉入10mL比色管，用90%丙酮定容為10mL，搖勻。

1.4.1.3測定。將上清液在分光光度計上，用1cm光程的比色皿，分別讀取750nm、663nm、645nm、630nm波長的吸光度，并以90%丙酮為空白，按如下公式計算葉綠素a含量：

葉綠素a（mg/m3）= [11.64×(663-750）-2.16×(645-750）+0.10×(630-750）]V1/V/δ

式中：V為水樣體積（L），D為吸光度，V1為提取液定容后的體積（mL）, δ為比色皿光程（cm）。

1.4.2改進法

步驟(1)、(3)與規范法相同。

步驟(2)改為將干燥后的濾膜放入10mL具塞比色管中，加入少量的碳酸鎂粉末，再加入90%丙酮10mL，旋緊管塞，于50℃恒溫水浴鍋中萃取5min。充分搖勻后，放入4℃冰箱在黑暗中浸漬提取5h。

2 結果與討論

2.1 浸漬提取時間對葉綠素a濃度的影響

用改進法對微囊藻液的葉綠素a濃度進行不同提取時間的測定，并與規范法測定結果相比較，結果見表1。因規范法并未要求浸漬提取，這里采用浸漬0.5h的結果便于對比。

表1 改進法對微囊藻液不同提取時間的葉綠素a測定結果

該結果顯示改進法的測定結果高于規范法。浸漬提取時間在2h內，葉綠素a的濃度快速上升，但之后在24h內上升緩慢并逐步穩定。可見，浸漬提取2～24h都是可以的。選取5h作為改進法的適宜的提取時間。

圖1 葉綠素a濃度與提取時間的關系

2.2 規范法和改進法測定結果的統計比較

選取來自不同區域的含浮游植物豐富的5種地表水水樣，每次量取100mL，采用兩種方法進行平行測定，測定結果和統計見表2。

表2 規范法和改進法對比實驗結果

從表2可以看出，改進法的測定結果普遍高于規范法。采用配對數據的顯著性檢驗——t檢驗法，對表2的實驗結果進行數學統計檢驗，統計結果見表3。由表中可知，經t檢驗求得︱t︱=3.02。給定α＝0.05，由t界值表查得t0.05(4)=2.78，︱t︱=3.02＞2.78，說明改進法與規范法測定結果有顯著性差異。

表3　統計檢驗計算結果

３ 結論

規范法操作步驟略顯繁瑣，在樣品的研磨過程中，本來含量就低的樣品極易損失，不易收集。丙酮易揮發的特性，又使得研磨不能持久太久，造成規范法的測定結果偏低。改進法利用丙酮加熱提升了丙酮的萃取能力，延長浸漬時間，促進藻類細胞破裂，使更多的葉綠素a從細胞中釋放出來。在整個過程中，提取物始終保持在密閉的比色管中，保持了定容的體積，確保了葉綠素a濃度的可靠性。實驗證明，采用丙酮加熱、延長提取時間的方法可以提高對葉綠素a的提取，簡便易操作的特點更適用于大批樣品的數據監測。

[1] 國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法[M].北京:中國環境科學出版社,2002.