MiR-145調控下的基因 CDK6的 3’非編碼區片段的克隆與分子生物學檢測

宋靜文

(麥吉爾大學解剖與細胞生物學系,魁北克蒙特利爾 H3A 2B2)

在動植物基因組中廣泛存在一類非編碼蛋白的 RNA基因,產生長度大約為 21-24個核苷酸的 RNA,它們被命名為microRNA。這是一類具有調節其他基因表達活性的小RNA,在生物的發育過程中發揮著重要作用。最近的研究表明,miR-145有可能調節了多個 G1期阻滯基因包括 CCND2、CDK6和多個下游調節其他細胞周期的基因。所以認為miR-145的失活可能導致某些癌癥的發展。其中 CDK6基因的編碼產物調節控制細胞周期,特別是 G1到 S期的過渡。當細胞受到刺激時,G1期 cyclinD表達,并與 CDK4,CDK6結合,使它們磷酸化,再使下游的蛋白質如 Rb磷酸化,磷酸化的 Rb釋放出轉錄因子 E2F,促使許多基因的轉錄,從而允許 G1/S期轉換與 DNA合成。當 CDK6活性下降或者是被抑制時,可使 pRb由磷酸化變成低磷酸化狀態,在此狀態 pRb與轉錄因子 E2F結合,使 Rb基因對轉錄因子的抑制不能解除,從而阻止細胞從 G1期進入 S期,抑制細胞增殖,阻止細胞增長。本課題擬對人類基因組中的 CDK6的3’非編碼區 (Untranscription Region)片段進行克隆,并構建pMD-18T原核表達載體,再與 pGL-4載體進行連接,測序正確后轉化入 Hela細胞,同時把 miR-145轉入 Hela細胞進行熒光素酶系統的檢測,并為后續研究其與腫瘤細胞內重要 microRNA分子的調控關系提供材料。

1.實驗部分

1.1 試劑和儀器

pMD-18T,T4 DNA Ligase,ExTaqDNA polymerase,SacI,XhoI,DL2000、DL15000 DNA marker,10 ×DNA Loading Buffer,6×DNA Loading Buffer,GENE F INDER核酸染料,均由Takara公司生產

全血基因組DNA提取試劑盒,膠回收試劑盒,質粒DNA小量提取試劑盒,PCR產物純化試劑盒,由 Tiangen公司生產

THZ-312型臺式恒溫振蕩器,TGL-16G臺式離心機,DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 JY-SPFT型水平電泳槽,JY-600C型電泳儀,ZF-90型暗箱式紫外透射儀,DNA凝膠電泳儀,MG48+型基因擴增儀,S W-CJ-2F型雙面凈化臺SPX-150BS-II型生化培養箱

1.2 從全血基因組中提取目的基因 (實驗步驟詳見Tiangen試劑盒說明書)

1.3 引物設計

用 Primer5遵循引物設計原則來設計引物。再用BLAST通過序列比對,看此引物特異性的優劣。

根據我們要克隆的 CDK6 3’UTR的堿基序列和上述方法設計的引物序列:

5’TC GAGCTC TGTAAACGACAAGAATAA 3’(SacI,加2個保護堿基)

5’CCGCTCGAGCTCTACTCATTTAAAATTCT3’(XhoI,加 3個保護堿基)

1.4 PCR反應,克隆目的基因

以全血基因組為模板,以 CDK6的 3’UTR引物做 PCR反應 ,如表 1、表 2所示。

1.5 電泳檢測

在 140 V,110 mA,30 min條件下電泳,利用 GENE-Finder染料得到條帶與 marker比對,判斷基因是否成功得到。

1.6 電泳所得基因膠回收 (實驗步驟詳見 Tiangen試劑盒說明書)

1.7 T質粒構建

人類 CDK6基因包含miRNA結合位點的序列 (CDK6 3’UTR)片段用 PCR的方法從人血基因組 (最好模板用新鮮提取的基因組 DNA,模板質量對于 PCR結果的影響較大)中克隆出來 (克隆時可能需要做梯度 PCR,摸索最佳的退火溫度,從而得到特異的產物,若無此實驗條件,需要做多次 PCR),PCR產物跑膠,切下特異條帶,經過膠回收試劑盒回收。

表 1 PCR反應體系

表 2 PCR反應條件

目的基因與 PMD-18T用一定體系 (插入片段 2.5μL,pMD-18T 0.5μL,Solution 2.0μL)連接 (16℃反應 30 min)后轉化入感受態細胞,1小時復蘇后涂板過夜培養,在長出菌落的氨芐培養基上挑取單菌落,進行菌落 PCR,同時在另一個氨芐培養基的板上備份,若菌落 PCR為陽性,則挑取相應備份板上的菌落擴大培養后用 Tiangen試劑盒小量提取質粒,然后用 SacI和 XhoI進行雙酶切,之后電泳檢測,若有切開的空 T載體和目的條帶,則對提取的質粒進行測序。

1.8 質粒 DNA的小量提取 (實驗步驟詳見 Tiangen試劑盒說明書)

2.結果與討論

2.1 CDK63’UTR克隆反應

設退火溫度 55℃,延伸時間改為 2分鐘,一共 29循環,引物濃度稀釋 10倍后各取 1μL,以全血基因組為模板PCR。電泳結果出現明顯的目的條帶。如圖 1所示。

分析影響 PCR反應的因素:

(1)模板。①模板保存時間過長已經被降解,②模板中含有 Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚,⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。

(2)酶失活。需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加 Taq酶或溴乙錠。

圖 1 CDK63’UTR的 PCR反應 (泳道 2)

(3)引物。引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是 PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看 OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做 PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

(4)Mg2+濃度。Mg2+離子濃度對 PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低 PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使 PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

(5)反應體積的改變。通常進行 PCR擴增采用的體積為 20μL、30μL、50μL、100μL,應用多大體積進行 PCR擴增 ,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20μL后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。

(6)物理原因。變性對 PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低 PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是 PCR失敗的原因之一。

(7)靶序列變異。如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其 PCR擴增是不會成功的。

(8)退火溫度 (在無數次改變條件嘗試后,本人發現在PCR條件優化最重要的因素是退火溫度,故后期著重研究退火溫度)。根據所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的 Tm值,所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的 Tm 5℃,以 2℃為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。

2.2 與 T載體連接

把 PCR產物膠回收后與 PMD-18T載體連接,轉化入制備好的感受態細胞中,鋪在平板上過夜。平板上長出的菌落如圖 2所示。

圖 2 過夜培養后平板上長出的單菌落

分析連接不成功的可能因素:

(1)T載體濃度過低。T載體不能稀釋,就用原倍的,50 ng/μL。

(2)PCR產物膠回收后濃度過低:PCR產物膠回收之后要電泳定量,且膠回收時洗脫緩沖液不能過量 (一般 50μL即可),T載體長度大概是 2600 bp,目的片段長度約 1900 bp,目的片段最終量應該在 80～200 ng之間,以達到目的片段和 T載體摩爾數比大約為 4:1～10:1。

(3)連接酶失活。用 T4 DNA連接酶沒問題,但 T4 Buffer有可能是反復凍溶的,里面的ATP可能失效了,需要補加 ATP。

2.3 菌落 PCR

在連入 CDK的 T載體的平板上挑單菌落進行 PCR,同時,把同一菌落用接種環挑在相應的平板上劃線培養,以做備份。CDK菌落 PCR電泳結果如圖 3所示。

圖 3 重組質粒菌落 PCR電泳結果 (自泳道 2至 9)

從圖 3中可見,前九孔為本次 PCR,除了 marker共挑單菌落 8個,其中第 1,3,6,7個單菌落均有目的條帶出現,菌落能在氨芐培養基上生長,說明有 T載體轉化,但不能排除空載體的存在,而有 CCDK目的條帶的出現說明此四菌落中,CDK基因已成功轉化至 T載體。

菌落 PCR很容易污染,造成假陽性。在做轉化時加入了連接產物,涂板,連接產物可能并未全部轉化,還有部分殘留,可能附著在平板及菌落上了,在做菌落 PCR時,這些連接產物就會成為模板,造成假陽性。

2.4 質粒提取

把成功重組的 T質粒用 Tiangen質粒小提試劑盒提取,電泳圖如圖 4所示。

圖中泳道 3,4,5為重組成功的質粒。但條帶非常淺,且大多在 5k左右。推測是提取質粒菌體量過少。

未成功提取出質粒的原因有很多:

(1)平板上的菌是雜菌,可以從菌落的顏色大小和生長時間進行判斷。

(2)提取質粒所用菌液量太少,最少應用 5μL來小提質粒。

(3)質粒提取液不正常,尤其是溶液 II,是否出現沉淀,如果出現沉淀應加熱使其澄清 (如果菌非雜菌很有可能是溶液 II的問題造成的)。

(4)操作不正確,裂解時震蕩用力過大造成大腸桿菌基因組斷裂。

2.5 酶切

用 XhoI和 SacI雙酶切提取的質粒,檢測是否有目的條帶。電泳結果如圖 5。

圖 5 重組 T質粒雙酶切

圖中泳道 1為 DL5000marker,泳道 6,7為雙酶切后的質粒,從圖中看出,酶切后無目的條帶。

核酶限制性內切酶作用于底物 DNA時,受到許多要素的制約,主要有以下幾個:

(1)底物 DNA樣品的純度。在制備 DNA樣品中,由于各種條件的影響,存在著一些非 DNA物質,這些物質有的對酶切反應影響較大,如抽提過程中,有機物質的殘留成份:酚、氯仿、酒精,都會破壞酶的活性,另外未除去的蛋白質,也會干擾酶的反應,殘留的染色體 DNA則會相對降低酶對底物DNA的濃度。

(2)離子濃度。限制性核酸內切酶專一性需要鎂離子,以作為輔基。并且要求一定的鹽離子濃度,在使用上,通常把限制性核酸內切酶對鹽離子的要求分為三類:高鹽、中鹽和低鹽,它們所需的 Na+分別為 100 mmol/L、50 mmol/L和0。如果離子濃度使用不當,酶反應不完全或會使酶的識別位點發生改變。

(3)底物 DNA的量。商品限制性內切酶以酶單位計算,一個酶單位的定義:在規定的溫度和緩沖液內,于 20微升反應液內 1小時完全消化 1微克DNA所需要的酶量。所以若是底物DNA的量超過酶的酶單位所規定的消化量,則反應不能完全。不過商品酶多是濃溶液,每微升含 10單位以上,價格昂貴,所以使用時要盡量節省。

(4)酶反應溫度與酶反應終止。大部分限制性核酸內切酶最適的反應溫度在 37℃,極個別在 60℃,所以酶反應后要使酶的活性失活時,可把反應液置于 65℃內保溫 10～15分鐘,以終止酶反應,但此法對個別酶 (最適溫度在 60℃的酶)不適合。本實驗因為采用雙酶切,有小片段產生,為了不讓小片段影響后續的連接實驗,我們采用 PCR反應體系中的 10×LoadingBuffer來終止酶切反應,清除小片段。

(5)酶反應時間。酶消化時間通常依酶的濃度,底物的濃度和純度而定,通常是 30分鐘到 2個小時,甚至更長些,但不能過長。因為商品酶極有可能含有雜酶,時間過久,微量雜酶的酶反應也會積累到干擾整個酶反應的程度。

3.結果與討論

3.1 已取得成果

(1)設計克隆 CDK6 3’UTR引物,克隆出 CDK6基因的3’UTR,電泳檢驗大小正確,有待測序驗證其序列正確性;

(2)膠回收的 PCR產物與 T載體相連;

(3)在平板上長出形態正常的單菌落;

(4)菌落 PCR顯陽性。

3.2 待解決問題

(1)與 T載體連接后提取重組質粒大小不對,或條帶過暗;

(2)重組質粒提取后酶切無目的條帶。

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