復原膠囊對膿毒癥大鼠腎組織HIF-1α表達的影響

毛健，李榮亨

（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶市 400016）

膿毒癥是由感染因素造成的全身性炎癥反應，其危重患者常發生多器官功能障礙綜合征（MODS），腎臟是最常受累的器官之一。目前有學者認同膿毒癥是包括微循環障礙的不可控的全身炎癥反應[1]。缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）是低氧應答過程中起重要作用的轉錄因子，參與能量代謝、血管生成、細胞凋亡、應激等相關基因的表達調控。研究表明，HIF-1α與缺血缺氧性炎癥反應密切相關[2]。筆者研究膿毒癥時應用復原膠囊，觀察其對模型大鼠腎組織HIF-1α表達的影響，以探討其對腎臟的保護作用機制。

1 材料

1.1 儀器

BX51T32E01型正立式顯微鏡（日本Olympus公司）；550型酶標儀（美國Bio-med公司）；5810R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；22331型梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；MDF-U50V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；UV-160IPC型紫外-分光光度計、AX200型精密電子天平（日本Kyoto公司）；RM2135型切片機（德國Leica公司）。

1.2 試藥

復原膠囊（重慶希爾安藥業股份有限公司）；大鼠IL-6ELISA試劑盒、DEPC、PCR引物（上海Invitrogen公司）；SYBR Primer Ex Taq Kit（大連寶生物工程有限公司）；4%PFA、依紅、蘇木紫、PBS粉（北京中杉金橋公司）。

1.3 動物

SD大鼠，♂，體質量200～300 g，第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所動物中心提供（動物合格證號：SYXK（渝）2007-0017）。

2 方法

2.1 模型復制及分組、給藥

模型復制參照文獻[3]。大鼠麻醉、固定后，沿腹中線作一條長2 cm的切口，分離出盲腸，在回盲瓣下端以1號絲線結扎盲腸。用16號針頭在腸系膜對側盲腸表面上下兩端各穿孔1個形成盲腸漏，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。大鼠蘇醒后觀察其體態及行為，以判斷模型的成功與否。術后大鼠予以自由攝食和飲水。假手術組只行腹腔關閉，不做結扎和穿孔。實驗分為4組，即假手術、模型及復原膠囊高、低劑量（6.65、3.325 g·kg-1）組。每組分為3、6、12、24 h 4個時相點，每個時相點4只大鼠。ig給藥，1天1次，連續給藥4 d后復制模型。

2.2 RT-PCR檢測腎組織HIF-1α mRNA的表達

按Trizol試劑盒說明提取組織總RNA。HIF-1α：被擴增的 cDNA引物長 200 bp，上游 5′-TGCTTGGTGCTGATTTGTGA-3′，下游 5′-GGTCAGATGATCAGAGTCCA-3′；CyclophilinA作內參：被擴增的cDNA引物長192 bp，上游5′-GCATACAGGTCCTGGCATCT-3′，下 游 5′-TCTTGCTGGTCTTGCCATTC-3′。采用TAKAKA試劑盒一步法。PCR反應條件為94 ℃5 min，1個循環；94 ℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃1 min，25個循環；72℃10 min，1個循環。瓊脂糖電泳PCR產物，凝膠成像處理系統拍攝圖像，記錄光密度值。產物含量＝HIF-1α擴增產物光密度值/CyclophilinA擴增產物光密度值。

2.3 ELISA檢測血清IL-6水平

大鼠心臟取血0.5 μL，室溫放置后離心取血清，－20℃貯藏。參照大鼠血清IL-6 ELISA試劑盒說明書進行。

2.4 生化指標檢測

大鼠心臟取血0.5 μL，室溫放置后離心取血清，檢測血清中尿素氮（BUN）指標的變化。

2.5 HE染色病理學觀察

取腎組織用4%多聚甲醛固定，PBS浸泡過夜，梯度乙醇脫水處理，二甲苯透明，石蠟包埋切片，常規HE染色，顯微鏡下觀察結果。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 復原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織HIF-α mRNA表達水平在各時相點顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，復原膠囊高劑量組在3 h時相點HIF-1α mRNA表達水平顯著增高（P＜0.05），其余各時相點均顯著降低（P＜0.01）；復原膠囊低劑量組24 h時相點HIF-1α mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。復原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達的影響見表1、圖1。

表1 復原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達的影響（±s，n＝4）Tab 1 Effect of Fuyuan capsule of mRNA expression of HIF-1α in kidney of model rats（±s，n＝4）

表1 復原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達的影響（±s，n＝4）Tab 1 Effect of Fuyuan capsule of mRNA expression of HIF-1α in kidney of model rats（±s，n＝4）

與假手術組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.sham group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別假手術組模型組復原膠囊低劑量組復原膠囊高劑量組HIF-1α mRNA 24 h 0.49±0.032.40±0.20＊＊1.55±0.41#0.56±0.29##3 h 0.39±0.120.65±0.07＊0.78±0.280.92±0.07#6 h 0.45±0.071.23±0.12＊＊1.00±0.270.87±0.08##12 h 0.42±0.031.41±0.13＊＊1.25±0.100.73±0.13##

3.2 復原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-6含量隨時間逐漸增高（P＜0.01）；與模型組比較，復原膠囊高劑量組各時相點IL-6含量均顯著降低（P＜0.05）。復原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響見表2。

圖1 復原膠囊對模型大鼠腎組織HIF-1α mRNA表達的影響A.假手術組；B.模型組；C.復原膠囊低劑量組；D.復原膠囊高劑量組Fig 1 Effect of Fuyuan capsule of mRNA expression of HIF-1α in kidney of model ratsA.sham group；B.model group；C.Fuyuan capsule low dosage group；D.Fuyuan capsule high dosage group

表2 復原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響（±s，n＝4）Tab 2 Effect of Fuyuan capsule on the level of IL-6 in model rats（±s，n＝4）

表2 復原膠囊對模型大鼠血清IL-6含量的影響（±s，n＝4）Tab 2 Effect of Fuyuan capsule on the level of IL-6 in model rats（±s，n＝4）

與假手術組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別假手術組模型組復原膠囊低劑量組復原膠囊高劑量組IL-6含量/pg·mL-1 24 h-1970.36±400.25＊1806.60±609.81587.91±410.08#3 h 204.69±60.52978.79±240.64＊1075.59±335.04#837.69±750.59#6 h-1133.23±160.44＊1118.79±217.26875.98±370.31#12 h-1315.13±340.51＊1226.25±668.35937.37±140.79#

3.3 復原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清BUN含量在術后12、24 h時相點顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，復原膠囊高劑量組大鼠血清BUN含量在12、24 h時相點顯著降低（P＜0.05）。復原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響見表3

表3 復原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of Fuyuan capsule on the level of BUN in model rats（±s，n＝4）

表3 復原膠囊對模型大鼠血清BUN含量的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of Fuyuan capsule on the level of BUN in model rats（±s，n＝4）

與假手術組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別假手術組模型組復原膠囊低劑量組復原膠囊高劑量組BUN含量/mmol·L-1 24 h-9.33±1.01＊9.14±1.397.33±0.64#3 h 5.58±0.416.28±1.545.68±0.835.63±0.456 h-6.65±0.856.78±1.295.94±0.5112 h-8.66±1.07＊8.97±0.937.04±0.65#

3.4 腎組織病理學變化

假手術組各時相點腎組織結構清晰；模型組3 h時相點可見腎小球毛細血管輕度淤血、紅細胞滲出；6、12 h時相點可見出血、腎間質腫脹明顯；24 h時相點腎小管區可見脫落壞死的上皮細胞。復原膠囊高劑量組上述病理學變化較輕。大鼠腎組織病理學切片見圖2。

圖2 大鼠腎組織病理學切片（HE，400×100）A.假手術組；B.術后3 h模型組；C.術后3 h復原膠囊高劑量組；D.術后6 h模型組；E.術后6 h復原膠囊高劑量組；F.術后12 h模型組；G.術后12 h復原膠囊高劑量組；H.術后24 h模型組；I.術后24 h復原膠囊高劑量組Fig 2 Histopathological section of kidney in rat（sHE，400×100）A.sham group；B.model group after 3 h of post-operation；C.fuyuan capsule high dose group after 3 h of post-operation；D.model group after 6 h of post-operation；E.fuyuan capsule high dose group after 6 h of post-operation；F.model group after 12 h of post-operation；G.fuyuan capsule high dose group after 12 h of post-operation；H.model group after 24 h of post-operation；I.fuyuan capsule high dose group after 24 h of post-operation

4 討論

膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克、大手術后的常見并發癥之一。臨床上膿毒癥缺乏有效的治療措施，死亡率也居高不下，但有研究表明膿毒癥早期給予體液復蘇、增加組織氧氣運輸，可使臨床預后明顯改善[4]。而以活血化瘀為基礎的中藥制劑血必凈是治療膿毒癥的有效藥物。因此，本研究模擬膿毒癥模型，并用中藥復原膠囊進行治療，觀察其對機體的保護作用。

本研究表明，模型組大鼠可觀察到精神萎靡、嗜睡、活動減少、呼吸急促、毛色晦暗、眼角存在分泌物等癥狀，腹腔內滲出液體增加并可聞及惡臭，這與文獻[3]報道一致，說明膿毒癥造模成功。模型組大鼠HIF-1α mRNA及炎癥介質IL-6隨時間延長逐漸增高，二者變化趨于一致，且腎組織病理學損傷逐漸加重，提示IL-6的大量激活是導致臟器損傷的重要因素；復原膠囊高劑量組HIF-1α及炎癥介質IL-6均降低，同時觀察到早期HIF-1α表達增高，但總體上腎組織學改變及腎功能損傷較輕。Cramer等[2]證實，HIF在調控髓細胞的能量代謝、聚集、遷移、侵襲及殺菌等方面起重要作用。因此，推測早期HIF-1 α mRNA的增高反映機體對病原體應答強度的增高，激活大量吞噬細胞以消滅病原體。而敖啟林[5]通過HIF-1decoy抑制法發現HIF-1α促進炎癥介質TNF-α的表達，并提示存在一個“炎癥-炎癥介質-HIF-炎癥介質-炎癥”的正反饋環。本實驗中筆者也證實；HIF-1α mRNA總體水平表達的降低使炎癥介質IL-6表達水平降低，對發生膿毒癥時的腎組織起保護作用。

復原膠囊由黃芪、曬參、當歸、川芎、丹參、三七等組成，具有益氣活血的功效。臨床及實驗研究證實，活血化瘀法不僅可調節凝血/抗凝失衡，抑制有害血管活性介質的釋放，還阻斷病因及不同病機的凝血功能紊亂觸發因素，在凝血功能紊亂不同階段發揮有益作用。黃芪具有補氣固表、脫毒排膿、斂瘡生肌之功，研究表明黃芪提取物可有效抑制LPS引發的人類羊膜細胞產生IL-6、前列環素（PGE2）及白細胞三烯4（LTC4），具有較好的抗炎作用；此外還有清除自由基、抑制P-選擇素表達的作用[6]。三七的有效成分除能夠減少白細胞與血管內皮的黏附及過氧化物的產生外，還可以減少肥大細胞脫顆粒及降低促炎因子IL-6和TNF-α的水平。黃芪、川芎、丹參、三七等藥能清除氧自由基，保護血管內皮細胞，降低毛細血管通透性，改善缺血/再灌注損傷，調節免疫，抑制血小板活化、聚集及血栓形成等[7]。

綜上所述，復原膠囊通過對HIF-1α表達的調控減輕炎癥反應，保護腎功能，可能與其多環節、多靶點調節免疫抑制全身炎癥反應，并改善微循環有關。

[1]Warren HS.Strategies for the treatment of sepsis[J].N Engl J Med，1997，336：952.

[2]Cramer T，Yamanishi Y，Clausen BE，et al.HIF-1 alpha is essential for myeloid cell-mediated inflammation[J].Cell，2003，112（5）：645.

[3]William J，Hubbard，Mashkoor Choudhry，et al.Cecal ligation and puncture[J].Shock，2005，24（1）：52.

[4]Chong AY，Lip GY，Freestone B，et al.Increased circulating endothelial cells in acute heart failure：comparison with von Willeband factor and soluble E-selectin[J].Eur J Heart Fail，2006，8（2）：167.

[5]敖啟林.脂多糖活化的大鼠巨噬細胞TNF-α產生新機制[J].中國病理生理雜志，2006，22（1）：148.

[6]Shon YH，Kim JH，Nam KS.Effect of Astragali Radix extract on lipopolysac charide induced inflammation in human amnion[J].Biol Pharm Bull，2002，25（1）：77.

[7]Sun K，Wang CS，Guo J，et al.Effect of Panax notoginseng saponins on LPS induced adhesion of leukocytes in rat mensenteric venules[J].Clin Hemorheol Microcirc，2006，34（1～2）：103.