淫羊藿總黃酮對高脂血癥大鼠血清NO、MPO的影響1)

蔡 輝,郭郡浩,董曉蕾,蔡佳宇,趙智明

高膽固醇血癥和高三酰甘油血癥誘導內皮損傷,最終導致動脈粥樣硬化(AS)形成,其高三酰甘油血癥引起血管損傷主要由于一氧化氮(NO)的生物利用度下降,出現氧化應激[1],損傷內皮細胞,加劇AS的炎性反應,激活轉錄因子κ B。髓過氧化物酶(MPO)水平與中性粒細胞激活程度之間存在極顯著的相關性,是中性粒細胞的活化標志物,調節NO對血管信號傳遞和舒張的作用,直接改變血管的炎癥反應性[2]。淫羊藿總黃酮為黃銅類化合物,其主要生物活性成分可改善內皮細胞、抗氧化等功能[3],對心血管系統存在潛在保護作用。本文就淫羊藿總黃酮減輕主動脈內皮氧化應激、炎癥損傷的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 實驗動物為剛斷乳的SD雄性大鼠35只,平均體重60 g左右,由南京軍區南京總醫院動物實驗中心提供,實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2003-0032;淫羊藿總黃酮由南京澤朗醫藥公司合成。

所有大鼠適應喂養1周,根據體重隨機分為配方高脂飼料(魚粉3%、豬油12%、白蔗糖 5%、雞蛋 10%、膽固醇 2%、膽酸鹽0.5%、甲基硫氧嘧啶0.2%和67.3%基礎飼料)組(26只)和普通飼料組(對照組,9只),高脂飲食組進食量控制在15 g/100(g?d),第12周末從大鼠眶后靜脈抽血檢測血脂以確定模型是否復制成功。再將高脂飲食組大鼠根據體重隨機分為模型組(8只)和高脂飲食加100 mg/kg淫羊藿總黃酮組(低劑量淫羊藿總黃酮組,9只)、高脂飲食+200 mg/kg淫羊藿總黃酮組(高劑量淫羊藿總黃酮組,9只)。12周后給予連續灌胃,干預4周。對照組和模型組予相應溶劑灌胃,均灌胃4周。藥物干預4周后處死大鼠。實驗結束后,禁食24 h,于次日08:00時,用20%氯胺酮,以1 mL/100 g劑量麻醉后,剪開胸腹腔,暴露心臟,左心室穿刺取血5 mL,室溫靜置1 h后,3 000 r/min離心5 min,分離血清置-20℃冰箱保存,待測血清指標;于冰盤中分離主動脈,置液氮中保存待測其他指標。

1.2 檢測指標和方法

1.2.1 血脂和生化指標檢測 三酰甘油(TG)用TPO-PAP法,總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用選擇性沉淀法,NO用硝酸還原法,MPO用鄰連茴香胺法,嚴格按試劑盒說明進行操作,試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2.2 主動脈病理檢測 大鼠主動脈弓與胸主動脈交界處取材,10%中性甲醛固定,石蠟包埋,水平橫切面制備石蠟切片,厚度4 μ m,蘇木素伊紅(HE)染色,100倍光鏡下觀察。

1.3 統計學處理 多組資料組間比較用單因素方差分析,方差齊性用LSD,方差不齊用Dunnett T3。并統計正態性,統計軟件用SPSS13.0。統計變量以均數±標準差±s)表示。

2 結 果

2.1 主動脈病理 組織病理學改變光鏡下,對照組血管壁結構清晰、內皮細胞完整無脫落,內膜薄,中層平滑肌層均勻、厚度正常,外層為疏松結締組織;高脂飲食組血管內皮細胞部分脫落,內膜增厚,血管壁向管腔內突出,可見中膜平滑肌增生、排列紊亂。而淫羊藿總黃酮小劑量組可見內膜輕度增厚,未見明顯平滑肌增生。淫羊藿總黃酮大劑量組干預組沒有明顯的病理改變。

2.2 各組血脂水平 造模后12周后高脂飲食組 TG、TC、LDL-C較對照組明顯升高(P＜0.05)。經淫羊藿總黃酮干預后16周末,模型組TG、TC較對照組明顯升高(P＜0.01),淫羊藿總黃酮組 TG、TC較模型組顯著下降(P＜0.05或P＜0.01),淫羊藿總黃酮大劑量組較小劑量組有明顯升高趨勢;HDL-C各組未見明顯差異(P＞0.05),但淫羊藿總黃酮干預組有升高趨勢;LDLC各組比較差異無統計學意義。詳見表1、表2。

表1 干預前第12周各組血脂比較(±s) mmol/L

表1 干預前第12周各組血脂比較(±s) mmol/L

組別 n TG TC HDL-C LDL-C對照組 9 0.929±0.150 1.831±0.226 1.255±0.092 0.195±0.051高脂飲食組 26 1.740±0.4141) 3.503±1.0901) 1.334±0.213 0.452±0.3281)與對照組,1)P＜0.01

表2 各組干預后各組血脂比較(±s)mmol/L

表2 各組干預后各組血脂比較(±s)mmol/L

組別 n TG TC HDL-C LDL-C對照組 9 0.798±0.195 1.690±0.293 1.187±0.148 0.153±0.050模型組 8 1.533±0.1721) 3.084±0.9841) 1.168±0.065 0.244±0.132淫羊藿總黃酮大劑量組 9 0.937±0.3963) 1.478±0.3022) 1.121±0.145 0.144±0.099淫羊藿總黃酮大劑量組 9 1.006±0.4322) 1.816±0.3072) 1.132±0.153 0.206±0.241與對照組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.3 血清NO和MPO 模型組血清NO顯著低于對照組和淫羊藿總黃酮組(P＜0.05或P＜0.01),淫羊藿總黃酮大劑量組較小劑量組有升高趨勢;模型組血清M PO明顯高于對照組(P＜0.01),淫羊藿總黃酮組較模型組明顯下降(P＜0.01),其中大劑量組下降趨勢明顯(P＜0.05)。詳見表3。

表3 干預后第16周各組血清NO含量和MPO活力

3 討 論

動脈粥樣硬化性疾病是一個全球范圍內的嚴重健康問題。高脂飲食為動脈粥樣硬化獨立危險因素,高脂飲食可增加的血漿膽固醇及低密度脂蛋白,對血管內膜進行功能性損傷,并加速動脈粥樣硬化形成[4]。高脂血癥不僅是動脈粥樣硬化的促發因素,而且貫穿其發生、發展的過程當中[5]。本研究通過高脂飲食造成高脂血癥大鼠,模型組TG、TC、LDL較對照組明顯升高,主動脈內膜HE染色顯示內皮細胞脫落、斷裂,平滑肌層增生。通過高脂飲食可誘導高脂血脂大鼠并出現主動脈內皮損傷。給予淫羊藿總黃酮干預后 TG、TC較模型組下降,HDL有所升高,可降低LDL,但無統計學意義。與文獻報道相符[6]。長期高脂飲食情況下增加的脂蛋白特別是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和膽固醇對動脈內膜造成功能性損傷,亦包括氧化應激損傷,氧化應激參與脂質氧化損傷動脈內膜[7]。高脂血癥狀態下,血管內皮中的巨噬細胞、炎性細胞聚集所釋放的超氧陰離子可加速 NO降解,影響 L-精氨酸轉化為 L-胍氨酸,使 NO生成減少,內皮依賴性舒張功能調節失衡,血管張力增加,結構重建,內皮損傷。增加血管內皮NO合成能力,提高NO介導的血管內皮依賴性舒張功能,來達到改善高脂血癥之血管內皮舒張功能障礙。在高膽固醇血癥大鼠L-精氨酸可抑制內皮細胞凋亡,可改善內皮細胞功能,抵抗動脈粥樣硬化進展[8]。本研究發現,模型組NO水平較對照組明顯下降,并且病理同時提示內皮損傷較明顯,說明NO在維持內皮細胞完整性有著重要作用。本實驗進一步證明通過提高血清NO水平可改善內皮功能。

MPO為血紅素過氧化物酶超家族成員之一,是氧化應激的一個主要標志物。M PO水平與中性粒細胞激活程度之間存在極顯著的相關性,是中性粒細胞的活化標志物,MPO還可以通過細胞信號通路將活化信號由胞漿傳遞至胞核內,誘導炎癥相關基因的表達,上調機體炎癥反應,促進炎癥效應細胞的增殖與活化,使效應細胞更易于穿越內皮屏障到達局部炎癥組織[2,9],易損斑塊形成的各個階段均與MPO有關,是預測斑塊易損性的炎性標志物。MPO催化過氧化氫和氯離子生成次氯酸,使LDL-C氧化成為ox-LDL,啟動 AS的發生,同時,M PO促進HDL-C的氧化,影響其膽固醇的逆向轉運作用,參與AS的發生、發展。當白細胞激活及脫顆粒時,M PO被分泌到血管腔,結合到內皮細胞,隨后跨細胞運動到內皮下基質,浸潤血管組織,直接消耗NO,從而影響NO信號傳導,使血管內皮舒張功能受損[10]。本研究中發現,模型組MPO較正常組明顯增高,NO明顯下降,說明MPO可能存在通過消耗NO,加重血管內皮細胞損傷。吡格列酮組干預4周后相比模型組M PO明顯下降,其內皮相對高脂未見明顯損傷,內皮比較完整,淫羊藿總黃酮改善內皮細胞功能,抗氧化應激,可能與升高NO,降低MPO有關,其詳細機制尚不明確有待進一步研究。

動脈粥樣硬化形成早期與血脂、炎癥、氧化應激、血小板活化、血栓形成密切相關。淫羊藿總黃酮抗炎、抗氧化應激可能與TG、TC降低、NO升高、MPO降低有關。

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