化濁通脈散對(duì)ASO家兔VEGF表達(dá)及血脂變化影響的研究*

李慎賢

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽 110004）

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（ASO），動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)病率居高不下。血清低密度脂蛋白的升高，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，因此降脂治療可減少動(dòng)脈血管內(nèi)皮損害，抑制AS的進(jìn)展，從而消除ASO的發(fā)病基礎(chǔ)[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食喂養(yǎng)家兔及股動(dòng)脈血管內(nèi)膜造成機(jī)械性損傷，模擬ASO形成過程以化濁通脈散干預(yù)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前后家兔的血脂變化及觀察局部血管斑塊血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，探討該方治療ASO的機(jī)制，為明確中藥作用靶點(diǎn)及新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新西蘭大耳白兔40只，4月齡，體質(zhì)量2.5～2.8 kg，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2003－0013。化濁通脈散組成:黃芪50 g，赤芍20 g，川芎20 g，當(dāng)歸20 g，地龍 20 g，紅花 10 g，川牛膝 10 g，水蛭 10 g，澤瀉10 g，焦山楂20 g，由三九藥業(yè)集團(tuán)提供，批號(hào)：0807021。阿司匹林：由沈陽奧華制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：080606。膽固醇：由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽有限公司提供，批號(hào)：F20071220。牛血清白蛋白注射液：由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20080815。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 免疫組化試劑盒：VEGF、生物素化羊抗兔IgG、鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）由武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào)：20090214。主要儀器：德國eppendorf 5417R離心機(jī)，雅培ARCHITECT ci8200全自動(dòng)生化免疫分析儀，Olympus Bx-41型光學(xué)顯微鏡，德國Ldilacom-1900型石蠟切片機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與分組 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，排除飲食異常者。1周后隨機(jī)分為4組，每組10只：即化濁通脈散組（A），阿司匹林組（B），模型組（C），假手術(shù)組（D），分籠飼養(yǎng)。D組喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水，其余3組自實(shí)驗(yàn)開始喂高脂飲食（正常飼料中加膽固醇1 g，豬油5 g），共喂養(yǎng)12周。其中實(shí)驗(yàn)開始第3天對(duì)全部家兔以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉，行左側(cè)股動(dòng)脈插管，在大腿近端沿左股動(dòng)脈走行處，鈍性分離出股動(dòng)脈約2 cm，動(dòng)脈壁上剪一小口后插入球囊至大腿近端處，球囊反復(fù)牽拉8次，以確保內(nèi)膜損傷，退出導(dǎo)管，慶大霉素稀釋液沖洗傷口。逐層縫合皮下組織和皮膚。術(shù)后肌肉注射慶大霉素8萬U 1次預(yù)防感染。手術(shù)后第4天A、B、C組靜脈注射牛血清白蛋白250 mg/kg；D組注射等量的生理鹽水。第13周各組均為普通飼料喂養(yǎng)，且A組予化濁通脈散7.2 g/（kg·d）混入飼料（藥物均根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算[3]），B組給予腸溶阿司匹林12.6 mg/（kg·d）混入飼料中，C、D兩組均未加任何藥物，在以上條件下共喂養(yǎng)3周。

1.2.2 各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定及方法 造模前與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別取兔耳緣靜脈取外周靜脈血2 mL，均以2500 r/min離心30 min，取得血清，應(yīng)用雅培全自動(dòng)生化免疫分析儀分別檢測(cè)甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）等，比較各組數(shù)值造模前后的變化及各組之間的變化。

1.2.3 取材及局部血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）免疫組化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束取血后，應(yīng)用麻醉法處死全部動(dòng)物，切取左髂股動(dòng)脈2～3 cm，留取1～2 cm縱行切開，肉眼觀察血管內(nèi)膜斑塊形態(tài)。利用免疫組化法觀察：1）用多聚賴氨酸（Poly－Lysine）少許涂載玻片待涼干備用。2）切片常規(guī)脫蠟至水。3）3%雙氧水（H2O2）室溫孵育8min，蒸餾水洗3次。4）將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復(fù)2次；冷卻后磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），pH 7.2～7.6洗滌2次。5）滴加5%正常山羊血清（BSA）封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。6）滴加適當(dāng)稀釋的一抗1∶150兔抗VEGF，4℃過夜，PBS洗5 min×3次。7）滴加二抗：生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min。PBS洗 2 min，3次。8）滴加試劑SABC，37℃20min。PBS洗5min×4次。9）取1mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5～30 min之間，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)時(shí)間。10）脫水，中性樹膠封片，備光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，偏態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05表示有差異，P<0.01表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)特點(diǎn) 肉眼可見，股動(dòng)拖拉處管壁明顯增厚，有較大的斑塊形成，管腔狹窄。光鏡下可以看到，斑塊中有大量泡沫細(xì)胞堆積，一些血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入斑塊周圍，伴有平滑肌細(xì)胞和膠原組織增生。

2.2 免疫組化結(jié)果正常兔血管壁無VEGF表達(dá)[4]，結(jié)果顯示：A組（圖1A）與C組（圖1C）相比：斑塊區(qū)表達(dá)的陽性率明顯降低（P＜0.01），B 組與 C 組，斑塊區(qū)陽性率無明顯差異（P＞0.05），A 組（圖 1A）與 D 組（圖 1D）相比，表達(dá)的陽性率略有升高（P＜0.01），因此，A組的表達(dá)陽性率明顯低于B組及C組，見表1。

表1 髂股動(dòng)脈血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的免疫組化分析(±sTab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of VEGF in the arteria iliacofemoralis(±s%

表1 髂股動(dòng)脈血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的免疫組化分析(±sTab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of VEGF in the arteria iliacofemoralis(±s%

n組別A組B組C組D組10101010 VEGF陽性率33.165±1.01750.321±1.28150.209±2.07724.936±1.735

2.3 血脂系列檢查結(jié)果造模前各組血脂指標(biāo)比較無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，A 組與 B 組、C組相比較：TC、TG、LDL－C 均較低（P＜0.01），有顯著性差異，而 HDL－C（P＞0.05），無顯著性差異。B 組與C 組相比較：TC、TG、HDL－C 無顯著性差異 （P＞0.05），但 LDL－C 低于 C 組（P＜0.01）。A 組與 D 組相比，通脈化濁散組TC、TG、LDL－C明顯低于D組（P＜0.01），而 HDL－C（P＞0.05）未見明顯差異。見表2

3 討論

有研究認(rèn)為降脂療法可以有效的治療AS，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方能明顯降低TC、TG、LDL-C等指標(biāo)，尤以降LDL-C最為突出。提示本方具有調(diào)節(jié)血脂、改善血脂代謝的作用，可能是通過降低TC、LDL-C來抑制VLDL-C的氧化修飾，減少炎癥因子導(dǎo)致的血管損傷，因此，有利于發(fā)揮穩(wěn)定粥樣斑塊的效果。

另外，本實(shí)驗(yàn)通過使用化濁通脈散對(duì)模型家兔動(dòng)脈硬化斑塊VEGF進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)化濁通脈散組與模型組相比，斑塊染色呈弱陽性表達(dá)，模型組、阿司匹林組與化濁通脈散組相比斑塊染色均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，化濁通脈散組的VEGF染色陽性面積明顯減少，提示本方可減少斑塊血管新生的作用，且與減少VEGF表達(dá)有關(guān)，所以化濁通脈散可有抑制斑塊內(nèi)血管新生，抑制斑塊生長(zhǎng)等作用。因此，化濁通脈散可針對(duì)ASO病理基礎(chǔ)展開治療，抑制VEGF表達(dá)，降低血脂減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，因而具有治療ASO的作用。

表2 各組動(dòng)物血脂指標(biāo)比較(±sTab.2 Comparison of blood lipid indexes in

表2 各組動(dòng)物血脂指標(biāo)比較(±sTab.2 Comparison of blood lipid indexes in

注：A組與B組、C組，有顯著性差異，*P＜0.01；A組與B組、C組，有顯著性差異，△P＜0.01；A 組與 D 組，有顯著性差異，●P＜0.01。

mmol/L組別A組various groups(±sB組C組D組治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后TC 1.96±0.7316.02±2.23*△#1.98±0.7019.98±1.242.00±0.1621.19±1.391.99±0.957.71±1.52*TG 1.58±0.607.52±1.17*△#1.55±0.7310.40±0.651.56±0.5110.71±0.651.55±0.533.72±1.26*HDL 0.62±0.510.63±0.290.63±0.100.62±0.110.61±0.640.61±0.310.60±0.480.64±0.34 LDL 0.61±0.506.21±1.09*△#0.61±0.187.70±0.61△0.61±0.6711.47±0.890.59±0.511.03±0.33*

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為ASO屬中醫(yī)“脈痹”、“脫疽”、“血癖”等范疇，其形成機(jī)制與寒凝血瘀相關(guān)，治療多以溫經(jīng)散寒，活血通脈為主，代表方劑如：陽和湯、四妙勇安湯，實(shí)際應(yīng)用體會(huì)療效并不十分理想。現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為本病多因飲食失節(jié)，多食膏粱厚味，而損傷脾胃，造成臟腑虧虛、濕濁內(nèi)生，導(dǎo)致痰瘀互結(jié)阻塞經(jīng)脈。因此，遵循“治病務(wù)求其本”的原則本方遵循此病機(jī)采用“行氣活血、化痰通脈”的治療原則配置而成。本方重用黃芪益氣，推動(dòng)氣血運(yùn)行，并激發(fā)臟腑功能活動(dòng)，以助痰濕運(yùn)化；當(dāng)歸重在養(yǎng)血活血祛瘀通脈；兩藥合用可宣通氣血共為君藥。地龍、水蛭、紅花、赤芍活血散瘀通經(jīng)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究具有抗凝作用，防止血栓形成；澤瀉、焦山楂泄?jié)窕瘽幔薪笛饔茫瑑山M共為臣藥。牛膝引藥下行直通下肢，兼以活血，為佐使藥；全方共湊益氣活血、化濁通脈之功效。上述實(shí)驗(yàn)也以證明本方對(duì)ASO形成的不同環(huán)節(jié)起到了干預(yù)作用[5]。

[1]Danlel Steinberg.Atherogenesis in perspective:Hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime[J].NatMed,2002,8(11):249-259.

[2]Haug C,Lenz C,Diaz F.Oxidized low-density lipoproteins stimulate Extrace llular matrixmetalloproteinase inducer(EMMPRIN)release by coronary smooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:1823-1829.

[3]徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版，2002：202-203.

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[5]李慎賢，胡 瑩.化濁通脈散加疏血通治療早期動(dòng)脈硬化閉塞癥 80 例療效觀察[J].2005；28（3）：39-41.