HPLC法測定頭孢氨芐膠囊含量的不確定度分析

[摘要] 目的 建立 HPLC法測定頭孢氨芐膠囊含量的不確定度分析的方法。方法 通過建立 HPLC法測定數學模型，找出影響不確定度的因素，并對各個不確定度分量進行評定，計算各變量的不確定度，由此計算合成不確定度，最終給出測量結果的擴展不確定度和置信水平。結果 計算各分量的相對標準不確定度，由此計算合成不確定度及擴展不確定度(P=95%，K=2)。結論 建立的不確定度計算方法可用于HPLC法測定頭孢氨芐膠囊含量的不確定度的分析。

[關鍵詞] 不確定度;HPLC法;含量測定;頭孢氨芐膠囊

[中圖分類號] R978.1[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2010)14-19-03

Uncertainty Analysis Assay for Cefalexin Capsules with HPLC

WANGZhengyu

Anhui Suzhou Institute of Drug Control，Suzhou 234000，China

[Abstract] Objective To establish a HPLC method for uncertainty analysis of Cefalexin Capsules.Methods The calculation formula of uncertainty was deduced in the procedure of determination the content in Capsules.Each active components of uncertainty was calculated the variable parameters among the procedures.The combined uncertainty and extended uncertainty and confidence was finally obtained by synthesized the uncertainties of various component variables.Results The mathematic model of uncertainty is establish for applicable to cvaluate the accuracy of assay of puerain injection. Conclusion The mathematic model of uncertainty of measureme establish is reasonable and reliable，it is applicable to evaluate accuracy of assay for the capsules with HPLC.

[Key words] Uncertainty;HPLC;Content determination;Cefalexin capsules

頭孢氨芐為臨床常用抗生素之一，其含量測定的準確性不但是評定藥品質量的重要指標，也直接關系到用藥的安全有效。不確定度是對測量結果正確性的可疑程度，評定測量結果最有效的方法是測量不確定度，中國實驗室國家認可委員會(CNAL)要求經CNAL認可的檢測實驗室必須建立測量不確定度的評定程序。本文根據《中國藥典》2010年版二部質量標準對頭孢氨芐膠囊進行含量測定，參考《測量不確定度評定與表示》[1]及《測量不確定度表示指南》[2]，對測量中各種不確定因素進行分析和合成，評定其含量的不確定度。

1儀器與試藥

日本島津LC-10Atvp型高效液相色譜儀，SPD-10Atvp型紫外檢測器，電子天平(型號:AB 135-S d=0.01mg)，頭孢氨芐對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:1300408-200209，純度:94.2%)，頭孢氨芐膠囊(生產廠家:巢湖中辰藥業有限公司，批號:090522，規格:0.125g)，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2方法與結果(表1)

2.1色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱:Phenomenex ODS C18(5μm、4.6mm×150mm);流動相:水-甲醇-3.86%醋酸鈉溶液-4%醋酸溶液(742∶240∶15∶3);檢測波長:254nm;流速:1.0mL/min;進樣量:20μL。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取頭孢氨芐對照品適量(a對照品24.80mg，b對照品25.61mg)，置25mL量瓶中，加流動相適量超聲處理5min使溶解，放置至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL置50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備

取本品20粒精密稱定，混合均勻，精密稱取細粉適量(a樣126.70mg，b樣109.30mg)，置100mL量瓶中，加流動相適量超聲處理5min使溶解，放置至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取10mL，置50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4樣品測定

分別精密吸取對照品溶液、與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定，按外標法(峰面積)計算含頭孢氨芐91.4%。

2.5測量數學模型

根據測定原理和過程，含量計算公式為:

Y=■×100%

Y:測得頭孢氨芐膠囊標示百分含量，A■:供試品峰面積，A對:對照品峰面積，W對:對照品重量(mg)，W樣:供試品重量(mg)， W:供試品平均裝量(mg)，f對:對照品稀釋倍數(mL)，f樣:供試品稀釋倍數(mL)，標示量為0.125g。

導出方差:

urel=■

2.6不確定度分量分析

2.6.1玻璃儀器引起的相對標準不確定度校準:實驗中所用玻璃儀器有:A級25mL、50mL、100mL量瓶，A級10mL單標移液管，由文獻[3]得容量允差分別為±0.03mL、±0.05mL、±0.10mL、±0.02mL，由于標定值比極限值出現的可能性更高，按三角分布，由允差引起的標準不確定度分別為:

u(25)=0.03/■=1.22×10-2mL，u(50)=0.05/■=2.04×10-2mL，u(100)=0.10/■=4.08×10-2mL;u(10)=0.02/■=8.16 ×10-3mL。

溫度:量瓶和溶液的溫度與校正時溫度不同和實驗室溫度變化而引起的體積不確定度。由于供試品溶液和對照品溶液是在相同條件下配制，溫差和溶劑的膨脹系數相同，故溫度引起的偏差被抵消。

玻璃儀器引起的相對標準不確定度為:

■(25)=u(25)/25=4.90×10-4，■(50)=u(50)/50=4.08×10-4，■(100)=u(100)/100=4.08×10-4，■(10)=u(10)/10= 8.16×10-4

2.6.2對照品稱量的相對標準不確定度■

(1)天平稱量重復性不確定度:所用電子天平(d=0.01mg)的鑒定證書給出的重復性誤差為±0.02mg，按矩形分布:W對-01= 0.02/■=2.08×10-2mg。

(2)天平示值不確定度:所用電子天平的鑒定證書給出的最大允差為±0.1mg，按矩形分布:

W對-02=0.1/■=6.93×10-2mg

試驗平行稱取對照品兩份，每份對照品稱量的相對標準不確定度分別為:

對照品A的urel(W對a)=■ =2.92×10-3

對照品B的urel(W對b)=■=2.82×10-3

所以對照品稱量的相對標準不確定度為:

urel(W對)=■=2.97×10-3

2.6.3對照品純度的相對標準不確定度urel(S)

對照品純度的標準不確定度u(S)屬B類不確定度。頭孢氨芐對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，純度為 94.2%，由于目前沒有給出不確定度的其他說明，故暫假定[4]其分散區間的半寬度a=0.25%，按均勻分布換算:u(S)=0.25%/■=0.14%，其相對標準不確定度為:urel(S)=■=1.49×10-3

2.6.4對照品峰面積的相對標準不確定度■

(1)對照品溶液1測量5次，峰面積為:1535953.9、1544548.8、1536833.7、1539751.9、1550731.0，平均峰面積A對1=1541563.9，標準偏差SD=7327.93

■= SD/A對1=7327.93/1541563.9=4.45×10-3

(2)對照品溶液測量3次，峰面積為:1568954.2、1572546.8、1570472.8，平均峰面積A對2=1570657.9，標準偏差SD=1803.44

同上可得:■= SD/ A對2=1803.441/1570657.9=1.15×10-3

對照品溶液色譜峰面積引起的相對標準不確定度:

■=■=4.60×10-3

2.6.5對照品稀釋引起的相對標準不確定度■

對照品配置過程中，兩份對照品共使用A級2個10mL單標移液管、2個A級25mL量瓶和50mL量瓶。由配置引起的相對標準不確定度為:

■=■=1.36×10-3

2.6.6供試品稱量的相對標準不確定度■

(1)天平稱量重復性不確定度:同2.6.2中(1)項，■=2.08×10-2mg。

(2)天平示值不確定度:所用電子天平的鑒定證書給出的最大允差為±0.1mg，按矩形分布:

u(W樣-02)=0.1/■=6.93×10-2mg

試驗平行稱取供試品兩份，每份供試品稱量的相對標準不確定度分別為:

供試品A的urel(W樣a)=■=5.71×10-4

供試品B的urel(W樣b)=■=6.62×10-4

所以，供試品稱量的相對標準不確定度為:urel(W樣)=

■=8.58×10-4

2.6.7平均裝量的相對標準不確定度■

(1)天平稱量重復性不確定度:同2.6.2中(1)項，■= 2.08×10-2mg。

(2)天平示值不確定度:所用電子天平的鑒定證書給出的最大允差為±0.1mg，按矩形分布:■=0.1/=6.93×10-2mg。

裝量差異實驗過程中共使用天平20次，所以裝量差異稱量稱量的相對標準不確定度為:

urel(W)=■=1.63×10-3

2.6.8供試品峰面積的相對標準不確定度■

(1)供試品溶液1測量峰面積 3次:1888939.0、1875526.1、1890427.7，平均峰面積 A樣1=1884964.3，標準偏差SD=8207.51

相對標準不確定度:■=SD/A樣1=8207.51/1884964.3 =4.35×10-3

(2)供試品溶液2測量峰面積3次:1655633.0、1637412.2、1649368.1，平均峰面積A樣2=1647477.1，標準偏差SD=9259.19

同上可得:=■SD/A樣2=9259.19/1647477.1=5.62×10-3對照品溶液色譜峰面積引起的相對標準不確定度:■=■=7.11×10-3

2.6.9供試品稀釋引起的相對標準不確定度■

對照品配置過程中，兩份對照品共使用A級2個10mL單標移液管、2個A級100mL量瓶和50mL量瓶。由配置引起的相對標準不確定度為:■=■= 1.30×10-3

2.7合成相對標準不確定度

urel=■= 9.47×10-3

測得結果合成標準不確定度uC(Y)=Y.urel=91.4%×9.47×10-3=0.9%

2.8擴展不確定度

u(Y)=k.uC(Y)，通常k=2或3，Y的可能值作正態分估計，本實驗取包含因子k=2(置信概率為95%)[5]，擴展不確定度為:u(Y)=1.8%

含量測定結果可表示為:Y±u(Y)，即91.4%±1.8%，k=2

3 討論

本文評估出頭孢氨芐膠囊含量測定的擴展不確定度為1.8%，表明供試品測定結果的分散程度符合HPLC法對準確度的要求，測定結果較為準確、可靠。HPLC按外標法測定含量時，增加測定次數、選用較大的定容體積、增加對照品取樣量均可以減小各步驟的不確定度分量，從而提高測定結果的準確性和可信度。

[參考文獻]

[1] JJF 1059-1999. 測量不確定度評定與表示[S]. 北京:國家質量技術監督局，1999.

[2] 魏吳. 化學分析中不確定度的評估指南[M]. 北京:中國計量出版社，2002:11-12.

[3] JJG196-2006. 常用玻璃量器檢定規程[S]. 北京:國家質量技術監督局，2007:7.

[4] 黃諾嘉，楊文紅. HPLC法測定蘆薈膠囊中蘆薈苷含量的不確定度評定[J]. 中國藥業，2009，12(9):1318-1320.

[5] 李金海. 誤差理論與測量不確定度評定[M]. 北京:中國計量出版社，2003:148.

(收稿日期:2010-03-30)