線粒體差異蛋白質組學在神經系統疾病中的研究進展

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.23.010

近年來，蛋白質組學的發展為系統性、整體性的分析線粒體蛋白質組提供了可能性，現將蛋白質組學技術在神經系統中的研究做一綜述。

線粒體蛋白質的分離鑒定

傳統的基于凝膠電泳的蛋白質鑒定技術:如雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)結合質譜技術。

近幾年來，2DE技術有了很大發展。差異凝膠電泳(DIGE)是2DE的發展，DIGE技術最早在1997年由Jon Minden實驗室提出，其技術路線是將樣品在電泳前標記Cy2、Cy3和Cy5這3種熒光染料(其中Cy2作為用Cy3、Cy5標記的蛋白質內標，用以比較數據庫中各個膠之間的蛋白質的量的差異)，然后將標記后的3種樣品混合，同時在一塊膠上進行電泳。該方法的靈敏度高，可以檢測到100～200pg的蛋白質，線形動態范圍在5個數量級左右。此外，還有有固相pH梯度(IPC)凝膠電泳、雙向高效柱層析技術以及毛細血管電泳法，2DE仍在不斷完善中[1]。在這項技術中，天然狀態的膜蛋白(完整的復合體)首先要成為可溶的，然后在第一相的電泳中被溶解。在第二相中利用變性凝膠分離這些復合體，將它們分解成亞單位。這項技術也使得檢測線粒體呼吸鏈中的復合體變得容易。

基于非膠體系的多維層析分離與生物質譜相結合的技術路線(Mud PIT)。多維毛細管LC-ESI-MS/MS蛋白質認定技術(MudPIT)和從混合物中分離蛋白質的鳥槍法很有前途。鳥槍法是將純化的線粒體直接用一種或多種蛋白酶水解成肽段后，分別用離子交換和不同種類的反相色譜分離肽段后，以離線或在線方式與ESI-MS(Q-TOF)或離子阱質譜聯用，進行蛋白質鑒定，這種方法對于蛋白質的分離較為簡單，但對色譜的要求提高。MudPIT和2DE相比，是更強大的把蛋白質從細胞和組織中分離出來的方法，但是它是非定量的。為了定量混合的蛋白質復合物，Gygi等引進了同位素標記親和(ICATs)，這項技術被成功的用來檢測膜蛋白。

線粒體蛋白質組學在神經系統疾病中的研究

大腦是一個相當復雜的器官，傳統的研究方法已經不能滿足研究大腦結構和功能的需求。另一方面，大腦是一個耗能多的器官并且只能利用糖酵解過程中產生的能量。因此，線粒體的功能對于大腦很重要。細胞器蛋白質組表達譜的研究進展促使了腦蛋白質組的研究開始向線粒體、微體、胞漿和細胞質膜蛋白質組等特定的亞細胞組分的分析方向發展，如突觸小體、突觸膜、突觸小泡和突觸后富集區都已成為蛋白質組學研究中的目標組分[2]。

Thierry Rabilloud等運用蛋白質組學技術研究了這些突變是否會廣泛的影響線粒體蛋白質。他們分析了同胞雜種細胞的正常和有點突變的MELA或MERRF綜合征病人的幾百個線粒體蛋白，發現了一些上調和下調的蛋白。通過質譜鑒定發現了核編碼的細胞色素C氧化酶亞單位中的兩個蛋白水平在呈現出顯著下降。他們的發現顯示了線粒體rRNA突變基因核核編碼的的蛋白穩態之間有密切關系。作者認為他們為大規模研究線粒體功能紊亂提供了一個有潛力的模式。Mark A.Lovell[3]用同位素親和標記(ICAT)和雙向液相色譜、串聯質譜(2DLC/MS/MS)技術定量研究了小鼠原代皮層神經元培養細胞暴露于25microM淀粉狀蛋白肽16小時后線粒體蛋白質的變化。他們鑒定出10蛋白包括Na/K-轉運ATP酶，絲切蛋白，二氫嘧啶酶，丙酮酸激酶和電壓依從性陰離子通道1(VDAC1)有顯著變化(P<0.05)。與能量生成有關的蛋白含量的上調提示淀粉狀蛋白?肽作用后誘導的凋亡可以導致與ATP生成有關的蛋白的合成和釋放以維持代謝功能。Frank Gillardon[4]分析了過度表達人淀粉樣前蛋白(K670N，M671L)的Tg2576小鼠的海馬線粒體蛋白質組變化。發現熱休克蛋白70有顯著變化，提示有明顯的氧化應激。接著，海馬和非海馬區的線粒體蛋白被用IEF或Blue-native凝膠電泳技術在第一向分離并在第二向用了SDS-PAGE技術。在呼吸鏈復合體I和III中發現了大量的亞單位組成成分的變化。通過寡核苷酸序列分析分析沒有檢測到這些蛋白的相應的mRNA水平的變化。他們得出結論:在Tg2576小鼠大腦中，在淀粉狀蛋白斑沉積前，線粒體蛋白質組和功能的變化提示線粒體是淀粉狀-凝聚物的一個早期作用靶點。

總之，神經系統的復雜性反映在細胞種類和突觸數量上。最新的有關神經系統線粒體蛋白質組學的研究為研究神經系統的不同部分和同一部分在不同理化和致病狀態下的情況提供了深入的探索。然而我們面臨的一個大問題是從人腦中取樣的困難，因此目前大多數研究還是建立在動物模型基礎上。

未來瞻望

運用蛋白質組的研究手段比較神經系統不同部位或同一部位在正常狀態和病理狀態下的蛋白質圖譜的差異，尋找疾病特異性蛋白質作為神經系統疾病診斷的分子標記，為診斷提供線索，具有重要的臨床價值。但蛋白質組學研究本身還存在許多缺點和不足，仍然有許多關鍵性的技術需要解決，無論從樣品的制備、分離到鑒定都需要發展和改進。另外，有關線粒體蛋白質的數據庫還很不完善，新鑒定蛋白的定位問題是研究線粒體蛋白質組學的一個重要方面，相信隨著現代生物技術和信息技術的飛速發展，蛋白質組學將為CNS 疾病的研究發揮更大的作用。

參考文獻

1 S.D.Patterson，Proteomics:evolution of the technology.Biotechniques，2003，35:440-4.

2 H.Jaffe，L.Vinade，and A.Dosemeci.Identification of novel phosphorylation sites on postsynaptic density proteins.Biochem Biophys Res Commun，2004，321:210-8.

3 M.A.Lovell，S.Xiong，W.R.Markesbery，et al.Quantitative proteomic analysis of mitochondria from primary neuron cultures treated with amyloid beta peptide.Neurochem Res，2005，30:113-22.

4 F.Gillardon，W.Rist，L.Kussmaul，et al.Proteomic and functional alterations in brain mitochondria from Tg2576 mice occur before amyloid plaque deposition.Proteomics，2007，7:605-16.