貞芪酪蛋白肽抑制C6細胞生長與誘導細胞凋亡的實驗研究

摘 要 目的:探討貞芪酪蛋白肽(LACP)在體外抑制膠質C6細胞生長并誘導其調亡的作用。方法:采用不同濃度的LACP處理C6細胞，通過MTT法檢測LACP對C6細胞生長增殖的抑制作用，流式細胞技術檢測LACP作用后的細胞周期分布變化及誘導細胞凋亡情況。結果:LACP能抑制C6細胞的生長增殖，并呈時間濃度依賴性;同時LACP能影響C6細胞的細胞周期分布，使細胞阻滯于G1期;LACP可以誘導C6細胞發生調亡的改變。結論:LACP明顯抑制C6細胞生長并誘導其發生凋亡和細胞周期改變。

關鍵詞 貞芪酪蛋白肽 神經膠質瘤 C6細胞 凋亡

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.15.149

資料與方法

材料:C6細胞系大鼠膠質母細胞瘤。LACP，純度>99%，用二甲亞砜溶解，配成200mmol/L的儲備液，-4℃保存。試驗前用含10%小牛血清的1640培養液稀釋成不同濃度。四甲基偶氮唑藍(MTT)，二甲亞砜(DMSO)，流式細胞儀(XL)。

方法:①細胞培養:C6細胞接種于1640培養液培養，隔日用0.25%胰酶消化傳代。②MTT法檢測LACP對C6細胞作用的時效及量效關系取對數生長期C6細胞，按1×105/ml接種于96孔板內，分24、48、72小時三大組，各組細胞培養24小時。將培養液換成含不同濃度LACP的培養液，繼續培養24、48、72小時后各取出一塊培養板，觀察細胞生長狀態并拍照。隨后檢測490nm波長處的光密度(OD)值。③流式細胞儀檢測細胞周期分布收集對數生長期C6細胞，接種于6孔板中，設4組，每組設復孔培養24小時后，將培養液換成含不同濃度LACP繼續培養24小時。收集細胞，上流式細胞儀檢測細胞周期。④流式細胞儀檢測細胞凋亡收集對數生長期C6細胞，接種于6孔板中，設4組，每組設復孔，培養24小時將培養液換成含不同濃度LACP繼續培養24小時，流式細胞儀進行檢測，分析用藥后細胞凋亡的百分比。

統計學處理:實驗結果以均數±標準差表示，應用SPSS13.0統計軟件分析，根據資料性質應用方差分析或t檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

LACP作用于C6細胞后的倒置顯微鏡觀察:不同濃度LACP作用于C6細胞24、48、72小時后，倒置顯微鏡下觀察可見C6細胞隨著時間的延長及濃度的增大，細胞失去了正常的貼壁生長狀態，脫壁現象越加明顯。細胞形態發生了明顯變化，細胞變圓，細胞核固縮，核染色質致密，形狀不一、大小不等的團塊邊集于核膜，最終可見壞死細胞增多。

LACP作用于C6細胞后的生長抑制試驗在一定時間范圍內，隨著LACP濃度的增加，OD值相應減少。細胞的OD值與LACP濃度呈明顯的負相關關系，24、48、72小時時OD值與LACP濃度負相關系數分別為-0.91、-0.92、-0.96。經多因素方差分析，LACP在不同濃度(P<0.05)、不同時間(P<0.05)對C6細胞的生長抑制也不同。見表1。

流式細胞儀檢測細胞周期分布隨LACP濃度的增加，C6細胞的G1期細胞明顯增加，而S期比例減低(P<0.05)，G2期比例變化范圍不大(P>0.05)，并且這種作用呈劑量依賴性，說明了LACP可引起C6細胞G1期阻滯。

流式細胞儀檢測細胞凋亡:經流式細胞儀分別檢測0、50、100及150mol/L濃度LACP作用于C6細胞24小時后凋亡細胞在總細胞數中所占比例分別為0.08%、0.30%、2.31%及18.26%。說明隨著LACP濃度的增大，凋亡細胞明顯增多，凋亡細胞在細胞總數中所占的比例增加。

討 論

研究表明LACP對多種腫瘤均具有抑制作用^[1]。腫瘤細胞的基本生物學特征為增殖與分化的平衡失調，惡性腫瘤細胞由正常細胞分化障礙、惡變而來，表現為失控的增殖和去分化，許多惡性腫瘤細胞分化程度差，呈現胚胎細胞特征^[2]。LACP在腫瘤啟動、促進及發展3個階段都顯示抗腫瘤功效。本實驗顯示隨著LACP濃度的增加，它對C6細胞的抑制程度增大，細胞存活率減少。鑒于過度增殖是腫瘤細胞的一大特性，因而細胞周期與腫瘤的關系一直是生命科學研究中的熱門課題^[3]。我們的研究顯示LACP可引起C6細胞G1期阻滯。細胞凋亡對于保持多細胞機體的完整性及動態平衡起重要作用。如果細胞凋亡受抑，結果細胞死亡率下降，則細胞數目不斷增加，即表現出生長優勢，這是腫瘤形成的一個重要基礎。因而促進細胞凋亡對于腫瘤治療以及抗增生性疾病等具有重要的意義。

本研究表明:LACP能抑制體外培養的C6細胞生長，這種作用呈時間濃度依耐性;LACP能使C6細胞周期阻滯于G1期，阻斷細胞由G1期向S期的進程，而這種作用呈劑量依耐性;LACP可以誘導C6細胞發生凋亡的改變。LACP作為一種廣泛存在于自然界的植物補體，已被證實具有較為肯定和廣泛的抗腫瘤活性，是一種很有希望治療腦膠質瘤的天然化學防癌劑和化學治療藥物。

參考文獻

1 張延英，朱建坤，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽藥物血清誘導Bel-7402細胞分化的體外實驗研究.中國實驗方劑學雜志，2008，14(9):47-50.

2 楊建青，楊連粵.化療誘導肺腺癌A549細胞凋亡中p53和bcl-2基因的調控.中華肝膽外科雜志，2001，7(1):31-33.

3 花寶金.中藥有效單體對腫瘤細胞誘導分化及凋亡的機制研究.中國中醫基礎醫學雜志，2002，8(7):63-65.