平邑甜茶MhWRKY15基因cDNA克隆及其生物信息學(xué)分析

摘 要: 以平邑甜茶為材料，通過RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得平邑甜茶WRKY15基因的全長cDNA，命名為MhWRKY15（GenBank登陸號: GU576874）。生物信息學(xué)分析表明，該基因全長1 091 bp，包含810 bp的完整開放讀碼框，編碼269個氨基酸，屬于WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的第II組，為WRKY15家族成員；其編碼蛋白為可溶性蛋白，分子式為C1263H1941N365O425S12，相對分子量為29 423.2 ku，理論等電點為5.30；含有一個WRKY保守結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞核，存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位點，其二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主。

關(guān)鍵詞: 平邑甜茶； WRKY15； cDNA； 生物信息學(xué)

中圖分類號：Ｓ６６1．19 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－949－０4

Cloning of MhWRKY15 gene in Malus hupehensis and its bioinformatics analysis

SUN Xiao-li， RAN Kun，YANG Hong-qiang*， LI Qiang， JIANG Qian-qian

（College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University· State Key Laboratory of Crop Biology； 3Shandong Provincial Key Laboratory of Fruit Biology， Tai’an，Shandong 271018 China）

Abstract: Full-length cDNA sequence of WRKY15 gene from roots of Malus hupehensis （Pamp.） Rehd. var. pinyiensis Jiang， which was tentatively designated as MhWRKY15， with GenBank accession number GU576874， was acquired by RT-PCR and RACE with primers designed respectively based on the EST sequence. Bioinformatics analysis indicated that MhWRKY15 was 1 091 bp in length， containing an open reading frame of 810 bp and encoding 269 amino acids， and it belonged to group II of WRKY transcription factors and was one member of WRKY15 family. The results also showed that the protein encoded by MhWRKY15 was a soluble protein， with the molecular formula C1263H1941N365O425S12， the relative molecular weight was 29 423.2 ku and the isoelectric point was 5.30. There was one conserved WRKY domain in the protein sequence. The protein might be located in nucleus， and there were many phosphorylation sites， N glycosylation sites and O glycosylation sites. The predicted secondary structure demonstrated that random coil was the most important structural conformation.

Key words: Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.； WRKY15； cDNA； Bioinformatics

WRKY是植物特有的一種N端含有7個絕對保守的氨基酸序列（WRKYGQK）及鋅指結(jié)構(gòu)（CX4-7 CX22-23HXH/C）的轉(zhuǎn)錄因子[1-2]，它通過與核心序列為（T）（T）TGAC（T/C）的W-box順式元件特異結(jié)合而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3-4]。目前，在擬南芥和水稻等植物中已克隆了大量WRKY成員[5-6]，根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域個數(shù)及鋅指結(jié)構(gòu)特征，這些成員可以分為3類。第Ⅰ類含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域；第Ⅱ類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型；第Ⅲ類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型[7]。WRKY明顯受真菌、冷害、高溫、干旱及鹽脅迫等誘導(dǎo)，并參與胚胎形成、種皮及腺毛發(fā)育等多種過程[1-2，7]。平邑甜茶是蘋果的優(yōu)良砧木，克隆其轉(zhuǎn)錄因子并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對于蘋果砧木的分子調(diào)控及遺傳改良有重要意義。

1 材料和方法

1.1 總RNA的提取及檢測

取具4~6片真葉的平邑甜茶[Malus hupehensis （Pamp） Rehd. var Pinyiensis Jiang]，采用改進(jìn)快速CTAB法提取根系總RNA[8]，瓊脂糖凝膠電泳及Eppendorf核酸蛋白測定儀檢測質(zhì)量及濃度。

1.2 MhWRKY15基因的克隆

按照RNA PCR （AMV） Ver.3.0（TaKaRa）使用說明合成cDNA第1鏈，根據(jù)已知EST序列設(shè)計特異的上游引物P1: （5’-CAGATTATGAGCGACCAG GAG-3’）和下游引物P2: （5’-CGAGGAAACAAGTT GAAAG-3’），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。……