平邑甜茶MhWRKY15基因cDNA克隆及其生物信息學分析

摘 要: 以平邑甜茶為材料，通過RT-PCR和RACE技術，獲得平邑甜茶WRKY15基因的全長cDNA，命名為MhWRKY15（GenBank登陸號: GU576874）。生物信息學分析表明，該基因全長1 091 bp，包含810 bp的完整開放讀碼框，編碼269個氨基酸，屬于WRKY類轉錄因子的第II組，為WRKY15家族成員；其編碼蛋白為可溶性蛋白，分子式為C1263H1941N365O425S12，相對分子量為29 423.2 ku，理論等電點為5.30；含有一個WRKY保守結構域，定位于細胞核，存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位點，其二級結構主要以無規則卷曲為主。

關鍵詞: 平邑甜茶； WRKY15； cDNA； 生物信息學

中圖分類號：Ｓ６６1．19 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－949－０4

Cloning of MhWRKY15 gene in Malus hupehensis and its bioinformatics analysis

SUN Xiao-li， RAN Kun，YANG Hong-qiang*， LI Qiang， JIANG Qian-qian

（College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University· State Key Laboratory of Crop Biology； 3Shandong Provincial Key Laboratory of Fruit Biology， Tai’an，Shandong 271018 China）

Abstract: Full-length cDNA sequence of WRKY15 gene from roots of Malus hupehensis （Pamp.） Rehd. var. pinyiensis Jiang， which was tentatively designated as MhWRKY15， with GenBank accession number GU576874， was acquired by RT-PCR and RACE with primers designed respectively based on the EST sequence. Bioinformatics analysis indicated that MhWRKY15 was 1 091 bp in length， containing an open reading frame of 810 bp and encoding 269 amino acids， and it belonged to group II of WRKY transcription factors and was one member of WRKY15 family. The results also showed that the protein encoded by MhWRKY15 was a soluble protein， with the molecular formula C1263H1941N365O425S12， the relative molecular weight was 29 423.2 ku and the isoelectric point was 5.30. There was one conserved WRKY domain in the protein sequence. The protein might be located in nucleus， and there were many phosphorylation sites， N glycosylation sites and O glycosylation sites. The predicted secondary structure demonstrated that random coil was the most important structural conformation.

Key words: Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.； WRKY15； cDNA； Bioinformatics

WRKY是植物特有的一種N端含有7個絕對保守的氨基酸序列（WRKYGQK）及鋅指結構（CX4-7 CX22-23HXH/C）的轉錄因子[1-2]，它通過與核心序列為（T）（T）TGAC（T/C）的W-box順式元件特異結合而調節基因表達[3-4]。目前，在擬南芥和水稻等植物中已克隆了大量WRKY成員[5-6]，根據WRKY結構域個數及鋅指結構特征，這些成員可以分為3類。第Ⅰ類含有2個WRKY結構域；第Ⅱ類含有1個WRKY結構域，其鋅指結構為C2H2型；第Ⅲ類含有1個WRKY結構域，其鋅指結構為C2HC型[7]。WRKY明顯受真菌、冷害、高溫、干旱及鹽脅迫等誘導，并參與胚胎形成、種皮及腺毛發育等多種過程[1-2，7]。平邑甜茶是蘋果的優良砧木，克隆其轉錄因子并進行生物信息學分析，對于蘋果砧木的分子調控及遺傳改良有重要意義。

1 材料和方法

1.1 總RNA的提取及檢測

取具4~6片真葉的平邑甜茶[Malus hupehensis （Pamp） Rehd. var Pinyiensis Jiang]，采用改進快速CTAB法提取根系總RNA[8]，瓊脂糖凝膠電泳及Eppendorf核酸蛋白測定儀檢測質量及濃度。

1.2 MhWRKY15基因的克隆

按照RNA PCR （AMV） Ver.3.0（TaKaRa）使用說明合成cDNA第1鏈，根據已知EST序列設計特異的上游引物P1: （5’-CAGATTATGAGCGACCAG GAG-3’）和下游引物P2: （5’-CGAGGAAACAAGTT GAAAG-3’），以cDNA為模板進行PCR擴增。產物回收后克隆入pMD-18T載體，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒后測序；根據測序結果設計3’-RACE上游引物P3: 5’-CATGGTGGTCCTGGAGT TCT-3’，下游引物為B26通用引物: 5’-GACTCGAG TCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT，擴增得到3’端序列。根據中間片段和3’端序列，設計5’-RACE上游引物P4（5’-CATTGCCCAGTGTAATCCT-3’）和下游引物P5（5’-CATCTTAACCCTCCTTTCT-3’），按照5’-Full RACE Kit（Takara Code: D315）使用說明，得到5’端序列。最后設計全長引物P6（5’-ATG GACCCCACATTCTTCAG-3’）和P7（5’-TCAACAGA ATCTGAGCTTGTG-3’），擴增得到MhWRKY15編碼區序列。

1.3 生物信息學分析

用DNAStar軟件中的EditSeq程序分析MhWRKY15全長序列，用ORF Finder （http://www. ncbi.nlm. nih. gov/gorf/gorf. html）尋找最大開放閱讀框（ORF）。在NCBI上通過Blastn和Blastp分別進行核苷酸和蛋白質序列同源性分析；利用ClastalW 1.8.1和Maga4.1軟件構建系統進化樹；分別采用Conserved Domains Database（http://www. ncbi. nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）、Expasy-ProtParam（http://expasy. org/tools/protparam.html）、TMpred（http://www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html）、SignalP3.0（http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）、CELLO（http://cello. life. nctu. edu. tw/）、NetPhos 2.0（http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/）、NetNGlyc 1.0（http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/）和NetOGlyc 3.1（http://www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/）對編碼蛋白進行保守域、氨基酸理化性質、跨膜區、信號肽分析、亞細胞定位、磷酸化位點、N-糖基化位點和O-糖基化位點分析。

2 結果與分析

2.1 平邑甜茶MhWRKY15基因cDNA全長序列的克隆

利用特異引物P1和P2，通過RT-PCR擴增得到長約350 bp的目的條帶（圖1-A），產物測序后確定為342 bp。通過RACE技術分別獲得330 bp的5’端（圖1-B）和741 bp的3’端（圖1-C）序列。在拼接序列起始密碼子和終止密碼子處分別設計引物P6和P7，擴增得到810 bp的條帶（圖1-D），測序結果與拼接的編碼區序列吻合。將該基因命名為MhWRKY15，GenBank登陸號為GU576874。

2.2 平邑甜茶MhWRKY15基因的核苷酸序列分析

EditSeq程序和ORF Finder分析顯示，MhWRKY15全長1 091 bp，含有810 bp的完整ORF，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，包括134 bp的5’非翻譯區（5’-UTR）和147 bp的3’非翻譯區（3’-UTR），共編碼269個氨基酸。

2.3 平邑甜茶MhWRKY15編碼蛋白的系統發生分析

2.3.1 蛋白保守域分析 Conserved Domains Database蛋白保守域分析顯示，MhWRKY15編碼蛋白在80~140位氨基酸之間含有一個WRKY保守功能域，其中WRKYGQK為7個絕對保守的氨基酸殘基；在該蛋白DNA結合域中具有一個C2H2型（C-X5-C-X23-H-X1-H）鋅指結構，表明該蛋白屬于第II組WRKY類轉錄因子；Blast分析確認該基因為WRKY15家族成員。

2.3.2 系統進化樹分析 以最大簡約法（MP）構建的多物種系統進化樹（圖2）顯示，與平邑甜茶（GU576874）進化關系最近的是蘋果（ADL36857.1），其次是大豆（ABS18444.1）和葡萄（XP002269267.1）。

2.4 平邑甜茶MhWRKY15編碼蛋白的性質分析

ProtParam Tool分析顯示MhWRKY15分子量為29 423.2 ku，分子式為C1263H1941N365O425S12，理論pI值為5.30，不穩定參數為52.50，屬于不穩定蛋白。TMPred跨膜區域分析表明，該蛋白從內到外及從外到內的跨膜區域均為0；SignalP 3.0信號肽分析顯示該蛋白沒有信號肽。NetPhos 2.0分析表明該蛋白存在15個絲氨酸位點、2個蘇氨酸位點和1個酪氨酸位點。NetNGlyc1.0分析顯示在22、30、40及152位氨基酸處存在4個N-糖基化位點；NetOGlyc 3.1分析表明存在16個O-糖基化位點。CELLO亞細胞定位分析表明該蛋白定位于細胞核。SOPMA分析表明，該蛋白α-螺旋、延伸鏈和β-轉角的比例分別為20.22%、11.61%和3.37%，無規則卷曲比例最高（64.79%）；用SWISS-MODEL構建的三維結構模型也顯示MhWRKY15主要以無規則卷曲為主（圖3）。

3 討 論

轉錄因子是結合在目的基因特定DNA序列上的蛋白質，通過增強或抑制基因的轉錄效率來調控基因表達，真核生物基因表達調控主要是在轉錄水平進行。WRKY轉錄因子作為一種誘導型調節因子，參與植物的多種防衛反應、生長發育調節以及物質代謝調節等各種重要生理活動[3，7]。研究通過生物學信息學分析發現MhWRKY15編碼蛋白存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位點，這表明磷酸化作用或糖基化作用能夠調節MhWRKY15轉錄因子。蛋白磷酸化作用由蛋白激酶催化完成，是細胞信號轉導過程中的作用環節；磷酸化位點的存在，表明MhWRKY15轉錄因子可受蛋白激酶調節，能夠在細胞信號轉導過程中發揮作用。事實上，WRKY通過與W-box元件發生特異性結合，可調節啟動子中含有該元件的基因的表達，能夠參與多種應答反應[2]。因此，MhWRKY15會在平邑甜茶轉錄調控、信號轉導及對脅迫應答等中起調節作用。

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冉昆． 平邑甜茶MhVPE基因的克隆及其生物信息學分析 [D]． 山東： 山東農業大學，2009.