基于cpSSR分子標記的香蕉種質(zhì)資源分類

摘 要： 應(yīng)用cpSSR分子標記來研究香蕉種質(zhì)資源分類，用篩選到的16對多態(tài)性引物對42份香蕉材料進行擴增，共檢測出86個多態(tài)性條帶，每對引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶為2~8，平均為5.5，多態(tài)信息含量為0.188 9～0.780 5。在相似系數(shù)為0.76時，供試的42份香蕉材料分成3大類群：類群Ⅰ為M. acuminata的全部亞種和供試的所有栽培蕉品種；類群Ⅱ為供試的全部M. balbisiana材料；類群Ⅲ為除了M. acuminata和M. balbisiana外其他全部供試的野生蕉材料。結(jié)果表明基于cpSSR分子標記的香蕉種質(zhì)資源的分類在種間具有較好的區(qū)分能力，但是cpSSR分類表現(xiàn)出較大的地理分布的相關(guān)性，而與形態(tài)特征關(guān)系不密切。

關(guān)鍵詞： 香蕉； 葉綠體SSR； 種質(zhì)資源； 分類

中圖分類號：Ｓ６６8．1 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1012－０7

The classification of Musa species using chloroplast SSR primers

LI Bo1，2，F(xiàn)ENG Hui-min3，WANG Jing-yi2， TONG He-lin1，2，CHEN You3，WU Yao-ting3*

（1Agricultural College，Hainan University，Haikou，Hainan 570228 China； 2Ministry of Agriculture's Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science （CATAS），Haikou，Hainan 571101 China； 3Qiongzhou University，Sanya，Hainan 572002 China）

Abstract: Choroplast genome was involved in the development of cpSSR primer pairs in Musa and the transferability of cpSSR markers from other plants across Musa wild species was observed. A set of 16 polymorphic cpSSR primers were selected to classify 42 related species/subspecies. A total of 86 polymorphic bands with an average of 5.5 bands (range 2 to 8) were identified. The PIC values ranged from 0.188 9 to 0.780 5. The UPGMA dendrogram divided the banana accessions into three main groups based on the similarity coefficient 0.76. GroupⅠincluded all the subspecies of M. acuminata and all the cultivated banana varieties. All the materials of M. balbisiana formed GroupⅡ. Group Ⅲ included all the wild materials except the species/subspecies of M. acuminata and M. balbisiana. The results showed that cpSSR marker was useful to distinguish the related species of Musa. The cluster analysis of cpSSR in present study revealed that the wild species/subspecies could be well grouped according to the geographical origin and but not to the morphological characters.

Key words: Musa； cpSSR； Germplasm resources； Classification

香蕉（Musa spp.）是多年生常綠單子葉草本植物，隸屬于姜目（zingberdles）芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa L.），是著名的熱帶水果，也是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國家的最重要作物之一。 香蕉栽培品種是尖葉蕉（Musa acuminata Colla， 記為A 基因組） 和長梗蕉（Musa balbisiana Colla， 記為B 基因組） 這2 個原始野生蕉種內(nèi)或種間雜交后代進化而成的[1-2]。依據(jù)形態(tài)特征和倍性特征可以把栽培蕉分為5個主要的基因組型（AA，AB，AAA，AAB，ABB）[2-3]。目前已知提供B基因組的M. balbisiana 未記錄有任何亞種，遺傳穩(wěn)定[4]。而提供A基因組的M. acuminata 具有豐富的亞種和變種，遺傳差異大，多樣性豐富，已描述的亞種和變種有：M. acuminata ssp. banksii，M. acuminata ssp. Burmanica，M. acuminata ssp. burmanicoides，M.acuminata ssp. Malaccensis，M. acuminata ssp. Microcarpa，M. acuminata ssp. siamea， M. acuminata ssp.truncate，M. acuminata ssp. errans，M. acuminata ssp.zebrina，M. acuminata ssp. halabanensis和M. acuminata var. chinensis等[5]。研究栽培香蕉的遺傳與起源的關(guān)系，就需要找出栽培蕉的原始父母本。香蕉具有特殊的遺傳方式，即葉綠體母本遺傳和線粒體父本遺傳[6]，這種遺傳方式為我們尋找香蕉栽培種的原始父母本，探索香蕉雜交發(fā)生的地點，以及建立香蕉栽培種的系譜提供了可能。

分子標記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于香蕉遺傳多樣性的研究，葉綠體微衛(wèi)星（Chloroplast Simple Sequence Repeat，cpSSR）是近年發(fā)展起來的一種新型高效的分子標記技術(shù)，由于具有共顯性、高多態(tài)性、分布廣泛性等優(yōu)點，又兼顧葉綠體基因組（chloroplast DNA，cpDNA）結(jié)構(gòu)簡單、相對保守、單親遺傳等特點，已被廣泛用于鑒定種甚至親緣關(guān)系很近的種，描述群體和個體水平的遺傳差異[7]。 但是，目前cpSSR的應(yīng)用瓶頸是引物數(shù)量有限。限制cpSSR分子標記應(yīng)用的難點在于引物的開發(fā)和篩選，從植物中提取高純度高質(zhì)量完整的葉綠體DNA很困難，且目前絕大多數(shù)植物的葉綠體DNA序列還是未知的，這就使得cpSSR引物的開發(fā)研究十分困難。有研究表明從一個基因組中分離出來的SSR可以用于同種、同屬中的其他個體[8-9]，這樣就可以大大降低SSR的開發(fā)成本，為SSR的廣泛應(yīng)用創(chuàng)造條件。目前，煙草、水稻、玉米、黑松等高等植物cpDNA 全序列已被測出，并在網(wǎng)上公開，國內(nèi)外學者已利用這些序列開發(fā)出了煙草[10-11]、小麥[12]、果梅[13]和柑橘[14]等的cpSSR引物，利用cpSSR引物在不同種的轉(zhuǎn)移擴增不僅尋找了遠緣作物間可共用的cpSSR引物，而且為香蕉葉綠體遺傳多樣性的研究創(chuàng)造了條件。

應(yīng)用 cpSSR 技術(shù)分析香蕉種間的遺傳關(guān)系，可以為香蕉的栽培種起源與進化提供依據(jù)，也可以為劃分香蕉的品種類型提供依據(jù)，培育新品種，推動香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

研究共使用42份香蕉材料，其中30份樣品材料來自于位于比利時魯汶大學的國際香（大）蕉改良網(wǎng)絡(luò)（International Network for the Improvement of Bnana and Plantain ，INIBAP）的國際轉(zhuǎn)運中心（International Transit Centre ，ITC），10份來自本課題組陳友在云南考察過程的收集，還有2份來自于廣東農(nóng)業(yè)科學院。具體材料見表1，所有材料的葉片保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物來源

從前人的研究報道中收集并合成了72對cpSSR引物，其中24對來自小麥[12]，46對來自于煙草[10-11]，另外2對來自于柑橘[15]。引物由華大基因科技有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取 采用改良CTAB法提取葉片的總DNA。

1.3.2 PCR擴增 PCR擴增體系：10×EX Taq Buffer 2 μL，5 mmol·L-1 MgCl2 1.6 μL，4×dNTP Mixture（10 mmol·L-1） 0.5 μL，10 μL Forward primer 1 μL，10 μL Reverse primer 1 μL，20 mg·L-1基因組DNA 2 μL，5 U·μL-1 Taq DNA polymerae 0.15 μL，最后加水至20 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃后延伸 7 min。將退火溫度設(shè) 12 個梯度，尋找最適退火溫度，其中最低 45.0 ℃，最高 65.0 ℃，其他的由程序自動生成，分別是45.0、45.5、46.9、49.0、51.4、53.8、56.2、58.6、60.9、63.1、64.5、65.0 ℃。

1.3.3 PCR產(chǎn)物檢測 采用 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 PCR 擴增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后取下凝膠進行銀染，染色程序參考張軍等[16]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以保存好的電泳照片記錄譜帶，按照相同遷移位上有多態(tài)性擴增帶記為1，無帶為0的方法，用Banscan 軟件輔助記錄電泳譜帶，多態(tài)性和重復(fù)性好的擴增帶被記錄。所有記錄的數(shù)據(jù)均錄入計算機。應(yīng)用 NTSYS-pc 2.01 軟件計算Nei 系數(shù)，用UPGMA （Unweight Pair-group Method using Arithemetic Averages）方法進行聚類分析，并繪制樹狀圖。計算引物的多態(tài)信息含量（Polymorphism Informa-tion Content，PIC）。 PIC =1-∑pij2，其中 pij 表示第 i位點上，第 j 個等位基因的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體SSR引物通用性分析

以小果野蕉（Musa acuminata var. chinensis）和野蕉（Musa balbisiana）為材料對收集的72對cpSSR引物進行PCR擴增，有24對引物擴增出條帶，其轉(zhuǎn)移擴增的效率為33.33%。應(yīng)用42個香蕉材料對可轉(zhuǎn)移的24對cpSSR引物進行PCR擴增，共16對引物表現(xiàn)出多態(tài)性，它們分別是：wct1、wct3、wct9、wct11、wct12、wct22、ccmp2、ccmp5、ccmp6、ccmp10、NTCP7、NTCP8、NTCP9、NTCP10、NTCP18、ARCP4（圖1為引物wct11的擴增電泳結(jié)果）。16對cpSSR引物共檢測出86個多態(tài)性條帶，每對引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶在2~8個，平均每對引物產(chǎn)生5.5個多態(tài)性條帶，產(chǎn)物大小在100~230 bp。PIC（多態(tài)信息含量）在0.188 9~0.780 5。Botstein等[17]首先提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)性信息量指標，當 PIC>0.5 時，該引物為高度多態(tài)性信息引物，當 0.25

2.2 基于cpSSR分子標記的香蕉種質(zhì)資源分類結(jié)果

根據(jù) 16對cpSSR 引物在 42個香蕉材料上的擴增結(jié)果，分別賦值后用Nei的方法計算材料之間的相似系數(shù)，所有供試材料的相似系數(shù)在0.65～0.99。應(yīng)用UPGMA方法對 42個香蕉材料進行了聚類分析。在相似系數(shù)為0.76時，供試的42份香蕉材料分成3大類群：類群Ⅰ為M. acuminata的全部亞種和供試的所有栽培蕉品種；類群Ⅱ為所供試的全部M. balbisiana材料；類群Ⅲ為除M. acuminata和M. balbisiana外其他全部供試的野生蕉材料（圖1）。

在相似系數(shù)為0.88時類群Ⅰ又可分為3個組，第1組為M. acuminata的全部亞種，第2組為基因型為AAA的栽培種，第3組為供試的其他栽培蕉材料。供試所有M. acuminata又可分為4類，其中小果野蕉（M. acuminata var. chinensis）單獨聚為一類，該種僅分布在我國云南。M2、M3和M4號材料聚在一組，并且M2與M3，M3與M4的相似系數(shù)高達99%，3者可能來源于相同的母本。第3個亞組為M5、M6和M7號材料，3者相似系數(shù)在0.97～0.99，3者在馬來西亞地區(qū)均有分布，可能來源于相同的母本。第4個亞組為M8和M9 2個材料。在第2組中，基因型為AAA的威廉姆斯和密歇爾分到一組，2者的相似系數(shù)為0.94，其母系關(guān)系十分相近。第3組為所有含B基因組的栽培蕉。

類群Ⅱ為地理來源不同的M. balbisiana材料，該類群各亞種之間的相似系數(shù)在0.80～0.90。

類群III為供試的其他野生蕉材料，在相似系數(shù)為0.82時，該類群又分為3個亞組。第1個亞組為血紅蕉Ⅰ（Musa sanguinea ssp. sanguinea）、血紅蕉Ⅱ（Musa sanguinea ssp. angle）、紫羅蘭野蕉（Musa chunii）、Velutina（Musa velutina）、阿寬蕉（Musa itinerans ssp）、河口指天蕉（Musa paracoccinea）、芭蕉（Musa basjoo）。除Velutina（Musa velutina）外，其他幾種均為本課題組陳友在云南實地考察中采集的。其中紫羅蘭野蕉為陳友等[18]初步鑒定的新種，血紅蕉Ⅰ（Musa sanguinea ssp. sanguinea）和血紅蕉Ⅱ（Musa sanguinea ssp. angle）為考察中發(fā)現(xiàn)的Musa sanguinea的不同類型，并建議劃分成2個亞種[19]。在這一組中，除河口指天蕉（Musa paracoccinea）外，Rhodochlamys組的材料相對集中聚到了一起，而Eumusa組的材料則聚到了一起。第2個亞組為來源于ITC的種間材料，從形態(tài)分類上，這些材料歸屬于Eumusa組、Rhodochlamys組、Callimusa組和Auatralimusa組，但是在本研究中，這些材料的分組并不明顯，而是穿插聚類。第3個亞組僅含2個材料，銅壁關(guān)野蕉（Musa tongbiguanensis）和云南芭蕉（Musa yunnanensis），2者均分布在我國云南，其母本具有較大的相似性。

3 討 論

3.1 cpSSR分子標記的通用性

葉綠體DNA 具有保守性、單親遺傳等特點，遺傳物質(zhì)在由親代向子代傳遞過程中不涉及基因重組，因此沒有選擇壓力。即使因突變等因素產(chǎn)生的變異，也不會受重組、缺失以及假基因的干擾而容易保存[20]。因此，cpDNA 有獨立的進化路線，具有cpDNA 特征的cpSSR 技術(shù)在植物群體結(jié)構(gòu)分析、種群分類、物種演化等研究領(lǐng)域有明顯的優(yōu)勢[21]。但是由于開發(fā)cpSSR引物的方法比較費時費力，所以本次研究采用前人發(fā)表的cpSSR引物序列，通過引物的通用性來進行香蕉種質(zhì)資源的研究。由于葉綠體DNA的保守性和進化率低于核基因組的特性，cpSSR引物具有通用性。這不僅表現(xiàn)在近緣種之間，而且在遠緣種之間也可以應(yīng)用[22]。我們所選用的72對cpSSR引物，在42個香蕉材料進行了通用性分析，16對引物均出現(xiàn)多態(tài)性擴增，其中10對具有高度多態(tài)性，通用性高，顯示出葉綠體高度的保守性。盡管 cpSSR 的多態(tài)性不如核 nSSR 的多態(tài)性強，但是可檢測到不同種屬間cpDNA 的差異和突變，在區(qū)別親緣關(guān)系很近的基因型方面有其特有的優(yōu)勢[23]。

3.2 基于cpSSR分子標記的香蕉種質(zhì)資源的分類

本研究中，應(yīng)用16對cpSSR引物對42個香蕉材料進行分析，結(jié)果供試材料分為3個類群，含有A基因組的野生蕉和栽培蕉聚為一類，還有B基因組的野生蕉聚為一類，而其他的全部野生蕉聚為一類。香蕉具有特殊的遺傳方式，是嚴格的葉綠體母本遺傳和線粒體父本遺傳的植物[6]，因此cpSSR反映的是芭蕉屬植物的母系關(guān)系，而雜交和基因的滲透與地理分布息息相關(guān)，所以在本研究中，香蕉種質(zhì)資源的分類更傾向于地理分布位置，而與形態(tài)特征的分類差異明顯。在類群I中，小果野蕉（M. acuminata var. chinensis）單獨聚為一類，這可能是由于其是唯一分布于我國的M. acuminata亞種。所以因地理分布的間隔，使得小果野蕉與其他的亞種母系關(guān)系相對較遠。在類群II中，M. balbisiana表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，遺傳相似系數(shù)在0.80～0.90。雖然目前未見任何關(guān)于M. balbisiana亞種的報道[5]，但是在本研究中，因為其地理來源不同，其母系關(guān)系表現(xiàn)出較大的差異性。在類群III中，除M. velutina外，在相似系數(shù)為0.82時，分布于我國的野生蕉材料聚為亞組一和亞組三，而從ITC引進的材料卻聚為一組。從形態(tài)分類上，ITC引進的這些材料歸屬于Eumusa組、Rhodochlamys組、Callimusa組和Auatralimusa組，但是在本研究中，這些材料的分組并不明顯，而是穿插聚類。其中，除M. laterita外，僅分布在巴布亞新幾內(nèi)亞的M. schizocarpa和M. boman相對聚到一起，分布在孟加拉國、印度東北部和緬甸的M. ornata單獨一支，而分布在馬來西亞和新幾內(nèi)亞區(qū)域的M.beccarii、M. jackeyi、 M. peekelii、M. maclayi和M. lolodensis則聚到了一起。這可能是由于同區(qū)域中同屬物種間的基因滲透和雜交更為明顯。

3.3 栽培蕉的系譜關(guān)系

Cheesman[1]和Simmonds[2]認為，栽培蕉來源于尖葉蕉（Musa acuminata Colla， 記為A 基因組） 和長梗蕉（Musa balbisiana Colla， 記為B 基因組） 這2 個原始野生蕉種內(nèi)或種間雜交后代進化而成。在本研究中共采用M. acuminata不同的亞種材料9份，不同地理來源的M. balbisiana材料7份，不同基因型的栽培蕉材料8份，結(jié)果栽培蕉聚到M. acuminata和M. balbisiana之間，這一結(jié)果驗證了栽培蕉來源于尖葉蕉和長梗蕉種內(nèi)或種間雜交這一學說。本研究中，在相似系數(shù)為0.76時，所有的栽培蕉都聚到了M. acuminata這一組，證明這些栽培蕉與M.acuminata的母系關(guān)系相對更近，而與M. balbisiana之間的關(guān)系相對更遠。在相似系數(shù)為0.85時，基因型為AAA的威廉姆斯和密歇爾聚到一起，而含B基因組的其他栽培香蕉聚到了一起，但是每個栽培蕉具體由何種野生蕉雜交而來在本研究中無法體現(xiàn)。關(guān)于栽培蕉的起源與進化還需要進一步從DNA序列上進行研究，以期找出其系譜進化關(guān)系。

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