基于16S rDNA序列比對分析贛南臍橙上柑橘黃龍病病原的分子特征

摘 要: 運用PCR技術以柑橘黃龍病病原亞洲種、非洲種和美洲種特異性引物對贛南臍橙上7個代表性柑橘黃龍病樣品進行擴增檢測，結合限制性內切酶XbaⅠ對贛南臍橙上的黃龍病病原16S rDNA基因RFLP分析和測定的16S rDNA基因序列同GenBank登錄的亞洲種、非洲種和美洲種的相應基因序列進行比對分析。結果表明，在贛南臍橙上檢測到黃龍病病原亞洲種，未檢測到非洲種和美洲種；贛南臍橙上黃龍病病原16S rDNA基因 XbaⅠ酶切具有亞洲種圖譜；16S rDNA基因序列比對分析表明7個贛南臍橙上的黃龍病病原間同源性為99.8%~100%，與亞洲種具有98.4%~99.9%的序列同源性，高于與非洲種/美洲種的序列同源性；與亞洲種間遺傳距離小于與非洲種/美洲種間的遺傳距離；系統聚類分析表明7個贛南臍橙上的黃龍病病原同亞洲種聚類在同一組群，具有較高的同源性和較近的親緣關系，而與非洲種和美洲種在系統發育樹中分屬不同的組群，試驗結果表明贛南臍橙上感染的黃龍病病原為亞洲種。

關鍵詞: 贛南臍橙； 柑橘黃龍病； 16S rDNA； RFLP分析； 序列比對

中圖分類號：Ｓ６６6．4 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1099－０5

Molecular characterization of Citrus Huanglongbing Bacteria in Gannan navel orange based on 16S rDNA sequences alignment

YI Long1，2， LU Zhan-jun1，2， ZHONG Ba-lian2，LAI Xiao-hua2， CHEN Ci-xiang2

（1College of Life and Environmental Sciences， Gannan Normal University， Ganzhou，Jiangxi 341000 China； 2Jiangxi Navel Orange Engineering and Technology Research Center， Ganzhou，Jiangxi 341000 China）

Abstract: Seven Citrus Huanglongbing (HLB) bacteria of Gannan navel orange in Jiangxi Province were detected by PCR with primers specific to Asian， African and American liberibacters. The XbaⅠrestriction endonucleases were used to digest the HLB 16S rDNA fragment of Gannan navel orange， and the sequences of 16S rDNA were sequenced and compared with those corresponding sequences of Asian， African and American liberibacters from GenBank by BioEidt and MEGA software. The results showed that the HLB pathogen of Gannan navel orange could be detected by the specific primers of Candiatus L. asiaticus. RFLP analysis demonstrated that the digested XbaⅠprofiles of 16S rDNA of the HLB isolates from Gannan navel orange had similar profiles with Ca. L. asiaticus. The 16S rDNA sequences of the 7 HLB isolates have identity ranging from 99.8% to 100%， and 98.4% to 99.9% with Asian liberibacters were higher identity than those with African liberibacters or American liberibacters. The same results were found by analyzing the sequences average nucleotide distance of HLB isolates of Gannan navel orange， Asian， African and American liberibacters. Phylogenetic analysis revealed that the 7 HLB isolates of Gannan navel orange were located in different phylogenetic clusters with African and American liberibacters， and classified into one cluster with Asian liberibacters， and shared higher homology and closer relationships. The results indicated that the HLB isolates of Gannan navel orange were Ca L. asiaticus.

Key words: Gannan navel orange； Citrus Huanglongbing； 16S rDNA； RFLP analysis； Sequence alignment

柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing， HLB）是柑橘產區毀滅性的病害，廣泛分布于亞洲、非洲、美洲等柑橘主產區，由一種迄今尚不能人工培養的韌皮部限制性細菌（Candiatus Liberibacter）引起[1-2]。根據病原物的熱敏感性、發生區域和蟲媒類型，柑橘黃龍病病原存在亞洲種（Ca. L. asiaticus）、非洲種（Ca. L. africanus）[3]和美洲種（Ca. L. amercanus）[4]。受全球氣候持續變暖的影響，黃龍病傳播媒介柑橘木虱活動范圍的擴大和患病苗木和果品不經檢疫、無證調運導致該病目前存在不斷擴增蔓延的趨勢。江西贛南目前臍橙種植面積近11.3萬hm2，已成為世界第一大臍橙集中產區，國內其他柑橘產區發生的黃龍病病菌菌系特征研究相對較多[5-6]，而針對贛南臍橙上攜帶的柑橘黃龍病病菌的研究尚未見報道。

利用16S rDNA可區分黃龍病病原種間的差別[3，7-8]，我們通過對贛南臍橙上具有代表性的7個柑橘黃龍病病原進行菌系類型檢測，限制性內切酶XbaⅠ對其16S rDNA進行RFLP分析和測定的16S rDNA序列同GenBank登錄的亞洲種、非洲種和美洲種的相應序列進行比對分析，明確贛南臍橙上HLB菌系類型和分子特征，對今后贛南臍橙上HLB的檢測、防治以及進一步研究具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 供試樣品

采自江西贛南臍橙上7個表現典型黃龍病癥狀的樣品Gn-H1~Gn-H7，陽性和陰性對照樣品由江西省臍橙工程技術研究中心提供。

1.2 總核酸提取及贛南臍橙HLB菌系類型檢測

參照周常勇等[9]的方法提取總核酸。根據Jagoueix等[3]和Teixeira等[7]的方法，用柑橘黃龍病亞洲種和非洲種特異性引物OI1/OA1和OI2c，美洲種特異性引物GB1和GB3對上述樣品進行擴增檢測。引物由上海生工合成，序列OI1: 5’GCGCGTATGCA ATACGAGCGGCA3’， OA1: 5’GCGCGTATTTTATAC GAGCGGCA3’，OI2c: 5’GCCTCGCGACTTCGCAACC CAT3’，GB1: 5’CAAGTCGAGCGAGTACGCAAGTAC T3’，GB3: 5’CCAACTTAATGATGGCAAATATAG3’。PCR擴增體系: 10 × PCR緩沖液（含Mg2+）2.5 μL，2.5 μmol·L-1 dNTP 2.0 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，核酸模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，加Millorple水補足總體積25 μL，置于Bio-Rad PTC-200 PCR儀上按94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，64 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35循環；72 ℃ 10 min程序擴增。亞洲種和非洲種擴增片段約1 160 bp，美洲種擴增片段約1 027 bp，PCR產物用1.2％瓊脂糖凝膠進行電泳，在溴乙錠染色后，置于Gel Doc XR+TM System型凝膠成像系統（Bio-Rad）中觀測并拍照。

1.3 贛南臍橙HLB病原16S rDNA擴增產物RFLP分析

按照Jagoueix等[3]的方法略作修改，取PCR產物10 μL，10 × Buffer 2 μL，0.1%BSA 2 μL，10 U· μL-1 XbaI 酶1 μL，加Millorple水補足總體積至20 μL，混合均勻后于37 ℃下反應1 h。2.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.4 柑橘黃龍病原16S rDNA基因序列測定及分析

采用上海生工的膠回收試劑盒，對16S rDNA擴增產物進行純化、回收，將純化的片段連接到pMD18-T載體，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞獲得靶片段的重組質粒DNA，選取陽性克隆菌株送交上海生工進行序列測定，所用測序儀器為ABI PRISM3730，測序試劑為BigDye terminator v3.1。

將測定的序列與GenBank登錄的黃龍病菌亞洲種、非洲種、美洲種的16S rDNA序列經Bio Edit 7.0.1多重比對分析序列變異位點和序列同源性，用MEGA4.0軟件以Kimura雙參數模型計算序列間遺傳距離，用鄰近法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹進行進化分析[10]。

2 結果與分析

2.1 贛南臍橙上HLB菌系類型檢測

贛南臍橙上7個具有典型癥狀的HLB代表性樣品和陽性對照以特異性引物OI1/OI2c經PCR擴增，均擴增出大小約1 160 bp的目標產物，陰性對照不能檢測到該擴增產物（圖1）。而以OA1/OI2c和GB1/GB3引物對未擴增出目標片段。結果表明在分析的贛南臍橙樣品上檢測到HLB病菌亞洲種，而未檢測到非洲種或美洲種。

2.2 贛南臍橙上HLB病原16S rDNA RFLP分析

通過對贛南臍橙上HLB病原16S rDNA PCR產物進行XbaⅠ酶切分析，所有的PCR產物均被酶切為大小分別640 bp和520 bp的2條片段（圖2），相互之間無明顯差異，與黃龍病病原亞洲種XbaⅠ酶切圖譜相一致[5-6]。

2.3 贛南臍橙上HLB病原16S rDNA 序列分析

2.3.1贛南臍橙上HLB菌群與亞洲種、非洲種、美洲種間的序列同源性分析 測定的贛南臍橙上7個HLB菌株16S rDNA的1 167 bp序列經比對分析共有2個堿基位點發生變異，分別是Gn-H1和Gn-H5菌株在第47位點為G，而其他菌株為A；Gn-H6菌株在第1 030位點為C，其他菌株為T，整個比對的序列不存在堿基缺失和插入。

將測序結果與從GenBank數據庫中下載的亞洲種: L22532（登錄號）、EU921622和DQ431997 ~ DQ432005；非洲種: L22533、AF137368和EU921619 ~ EU921621；美洲種: AY742824、EU921623 ~ EU921625的16S rDNA序列進行相似性比對分析。從表1可見7個贛南臍橙上HLB 16S rDNA序列同源性為99.8％~100％，同GenBank收錄的亞洲種同源性為98.4%~99.9%，非洲種同源性為94.2%~98.2%，美洲種同源性為94.0%~94.4%。序列同源性比對結果表明，贛南臍橙上HLB菌群與亞洲種的同源性最高，菌系類型最為相似。

2.3.2 贛南臍橙上HLB菌群與亞洲種、非洲種、美洲種間核酸遺傳距離 在分析的4個HLB菌群中16S rDNA序列的遺傳距離由表2可見，贛南臍橙HLB菌群與亞洲種間的核酸遺傳距離為0.004，遠小于其與非洲種間的核酸遺傳距離0.020。以及與美洲種間的核酸遺傳距離0.041，表明贛南臍橙HLB菌群與亞洲種間親緣關系更為接近。

2.3.3 16S rDNA 序列的系統發育樹構建 采用鄰近法對7個贛南臍橙上的HLB菌株和比對分析的亞洲種、非洲種、美洲種菌株構建系統發育樹。圖3可見，分析的菌株被分成3個類群，由贛南臍橙上HLB菌群和亞洲菌株聚類為第1組群（分支受98％的自展值支持）；非洲種菌株聚類為第2組群（分支受98％的自展值支持）；美洲種菌株聚類為第3組群（分支受100％的自展值支持）。贛南臍橙上7個黃龍病病原與亞洲種聚類在同一分支上，而與非洲種、美洲種在不同的分支上，且遺傳距離較遠，表明贛南臍橙HLB菌與亞洲種歸為一類，歸屬亞洲種。從聚類的第1組群分析可見贛南臍橙上7個HLB菌株在聚類樹上并未完全聚類在一起，而是與其他亞洲株系分散聚類在更小的分支上，如菌株Gn-H1和Gn-H5及DQ432003菌株聚類為一支，有63%的自展值支持，并未同其他5個贛南臍橙HLB菌株緊密的聚類在一簇上，暗示在贛南臍橙上HLB菌株彼此間有一定的差異，但并不明顯，菌株間是否存在種內分化，還需進一步分析確認。

3 討 論

柑橘黃龍病嚴重危害柑橘產業的健康發展，能侵染各種柑橘類植物，造成植株經濟壽命減短、產量降低、果品劣質失去經濟價值。近期的研究表明柑橘黃龍病菌具有區域遺傳多樣性，即在不同地理區域的菌系具有一定的遺傳多樣性，即使在某一特定地區也有一定的差異[11]。而贛南作為全世界最大的臍橙生產區，其黃龍病病菌的菌系類型、分子特征至今不詳。

在本研究中，對采自贛南臍橙產區的7個典型代表性樣品進行了特異性引物亞洲種、非洲種和美洲種的檢測，結果表明7個樣品均能被亞洲種特異性引物擴增檢測到，而不能被非洲種或美洲種特異性引物檢測到；XbaⅠ酶切菌株16S rDNA表明7個贛南臍橙上的HLB菌株產生的酶切圖譜與亞洲株系產生的酶切圖譜結果相一致，結合測定的16S rDNA序列分析，贛南臍橙上的HLB菌群與亞洲種間序列同源性在98.4%以上，高于與非洲種和美洲種間的序列同源性；核酸遺傳距離分析同樣表明贛南臍橙上HLB菌群與亞洲種間的核酸遺傳距離最小，而與非洲種和美洲種間的核酸遺傳距離較大，表明其與亞洲種的親緣關系更為接近；構建的系統發育樹分析表明，贛南臍橙上HLB菌株與亞洲株系聚類在一簇，而與非洲株系和美洲株系分屬不同的組群，說明贛南臍橙上HLB菌株與亞洲種更為接近，具有較高的親緣關系。結合特異性引物檢測結果、酶切圖譜、序列同源性、核酸遺傳距離及系統發育樹分析，表明贛南臍橙上HLB菌系為亞洲種，同時也明確其菌系的檢測特異性引物及其菌株的分子特征，為今后在贛南臍橙黃龍病的快速準確的檢測檢疫、無病毒苗木鑒定、科學有效的防控措施制定上具有重要的指導意義，同時為今后深入開展贛南臍橙黃龍病病菌的系統研究奠定了一定的基礎。

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