薄皮甜瓜白啄瓜枯萎病抗性基因Fom-2的同源克隆與表達(dá)分析

摘 要： 枯萎病是甜瓜等瓜類作物的毀滅性病害，F(xiàn)om-2基因介導(dǎo)了甜瓜抗枯萎病生理小種0和1，抗枯萎病育種是甜瓜等瓜類作物育種的重要目標(biāo)之一。通過(guò)同源克隆方法從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2，推定編碼1 099個(gè)氨基酸，所推定的蛋白質(zhì)序列經(jīng)Blast分析與數(shù)據(jù)庫(kù)中NBS-LRR類R基因具有較高的同源性。進(jìn)一步序列分析FOM-2蛋白具有典型的R基因的NB-ARC及SCOP 2個(gè)結(jié)構(gòu)功能域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，白啄瓜Fom-2基因經(jīng)枯萎病接種后表達(dá)明顯上調(diào)。白啄瓜Fom-2基因?yàn)榘鬃墓峡共∮N奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 薄皮甜瓜； 白啄瓜； 枯萎病； Fom-2基因

中圖分類號(hào)：Ｓ６52 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1059－０4

Cloning and transcriptional analysis of resistance gene Fom-2 from Cucumis melo ssp. Agrestis Jeffrey

YANG Jia-fu1， ZHAO Xuan2， LIU Ju2， YANG Xiao-dong2， WANG Shi-wei2， YANG Jing-hua2， ZHANG Ming-fang2

（1Vocational College of Science and Technology of Wenzhou， Wenzhou， Zhejiang 325006 China； 2Department of Horticulture， Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310029 China）

Abstract: Fusarium wilt （Fusarium oxysporum f. sp. melonis Snyder and Hansen） is one of destructive disease in melon crop production. Fom-2 gene was genetically identified to control the resistance of races 0 and 1. Resistance to fusarium wilt breeding is one of important targets for melon breeding. In this study， we cloned the Fom-2 gene from Baizhuogua melon （Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey） by using homological cloning method， which was deduced to encode 1099 amino acids and exhibited high similarity to NBS-LRR type of R genes in plant. The deduced FOM-2 protein contained NB-ARC and SCOP typical motifs of R gene. The expression of Fom-2 gene was highly induced after inoculation with fom race 1. In conclusion， the cloning of Fom-2 gene is good for breeding with resistance to fusarium wilt .

Key words: Cucumis melo； Baizhuogua； Fusarium wilt； Fom-2 gene

白啄瓜（Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey）屬于薄皮甜瓜類型，是溫州地區(qū)的特產(chǎn)瓜類作物，在溫州地區(qū)具有很大的栽培面積，栽培面積常年穩(wěn)定在600~700 hm2。同時(shí)，溫州地區(qū)還具有接近我國(guó)人口最密集的長(zhǎng)江三角洲蔬菜瓜果消費(fèi)市場(chǎng)的區(qū)位優(yōu)勢(shì)，當(dāng)天采摘，當(dāng)天即可送到市場(chǎng)，運(yùn)輸費(fèi)用低，白啄瓜等薄皮甜瓜生產(chǎn)具有非常強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力。近年來(lái)，隨著集約化、規(guī)模化的栽培，白啄瓜病蟲(chóng)害擴(kuò)散蔓延十分迅速，對(duì)甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)造成極大的影響，尤其是枯萎病的影響。侵染甜瓜的枯萎病病原菌屬于甜瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis Snyder and Hansen）。Risser等[1]認(rèn)為，可將尖孢鐮刀菌甜瓜專化型的病原菌劃分為4個(gè)生理小種，分別為race 0、 race 1、race 2和race 1， 2；3個(gè)抗病基因，分別為Fom-1、Fom-2和Fom-3，其中：Fom-1抗race 0和2，感race 1和race 1， 2；Fom-2抗race 0和1，感race 2和race 1， 2；Fom-3抗race 0， 1和2，感race 1， 2，且都是顯性基因[2]。Tarek等[3]根據(jù)文庫(kù)及Wang等[4]得到與Fom-2緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過(guò)圖位克隆方法克隆了基因Fom-2，這是到目前為止，甜瓜中唯一克隆到的抗枯萎病基因。在枯萎病的防治中，使用抗性品種是最有效的方法[5]。目前國(guó)外已育成的甜瓜抗性品種主要有：Doublon、Charentais與Hemed（含有Fom-1抗性基因）；CM17-187、Charentais 與Makdimon-1（含有Fom-2抗性基因）；MR-1、Top Mark和Perlita FR（含有Fom-3抗性基因）[1-2， 6-7]。我們通過(guò)同源克隆方法從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2同源序列，為白啄瓜抗枯萎病育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

材料采用白啄瓜（Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey）高代自交系，由本課題組提供，試驗(yàn)材料催芽后播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，日光溫室常規(guī)條件下生長(zhǎng)，待3葉一心時(shí)用于總RNA提取及枯萎病接種試驗(yàn)。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

總RNA的提取采用Plant Mini RNA Extraction Kit（QIAGEN）提取，提取的總RNA經(jīng)過(guò)RNase-free的DNase消化處理，去除基因組污染，所有操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA經(jīng)過(guò)甲醛變性電泳及濃度測(cè)定。取3 μg總RNA，采用Takara的cDNA第1條鏈合成試劑盒合成cDNA第1條鏈，所有操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 Fom-2基因的克隆

Fom-2基因的克隆采用同源克隆的方法，由于Fom-2基因大約有3 000 bp左右的長(zhǎng)度，本研究中采用2次PCR擴(kuò)增的方法擴(kuò)增5’及3’端序列，然后拼接在一起。采用的引物分別為：Fom-2-F1 ATGGGTGATTTCCTATGGACT； Fom-2-R1 AATCA ATCGTGCGTAGCTTG；Fom-2-F2 CAAGCTACGCA CGATTGATT；Fom-2-R2 CAAGTGGGGTTGGAGCATAT，所有引物在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行特異性檢測(cè)。以cDNA第1條鏈為模板，PCR反應(yīng)體系為95 ℃ 3 min，然后35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察、回收，回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體中，熱激發(fā)轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，鑒定陽(yáng)性克隆，選取3個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆用于ABI3330上進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 序列分析

序列分析采用NCBI、SWISS、SMART、ProtScale等在線分析及DNAMAN等生物信息學(xué)分析工具對(duì)核苷酸及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEG4.0軟件Neighbor-Joining方法構(gòu)建。

1.5 枯萎病接種

甜瓜枯萎病生理小種1懸浮孢子的制備，挑取枯萎病生理小種1的菌種，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d之后轉(zhuǎn)接到Bilay培養(yǎng)基上，搖床進(jìn)行培養(yǎng)（25～28 ℃，100 r·min-1）。培養(yǎng)3 d后經(jīng)2層紗布過(guò)濾后在血球板計(jì)數(shù)器下檢測(cè)孢子的數(shù)目并根據(jù)檢測(cè)情況用培養(yǎng)基將孢子數(shù)目調(diào)節(jié)到106個(gè)·mL-1備用。

枯萎病接種采用苗期傷根法接種枯萎病病菌，待瓜苗長(zhǎng)至3~4片真葉時(shí)，挖出，經(jīng)清水洗凈后，于孢子懸浮液（孢子懸浮液中含孢子數(shù)一般為106 個(gè)·mL-1）中浸泡30 min，再植回營(yíng)養(yǎng)杯培養(yǎng)，10 h后取樣，提取總RNA用于后續(xù)基因表達(dá)研究。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

定量引物為（Fom-2_QF1： 5’-TATGCTTGCGAATGTCCAAT-3’；Fom-2_QR1：5’-ACAACTCT CGAACGTGTTGC-3’），以甜瓜18S rRNA作為內(nèi)參基因。應(yīng)用ABI step one Real-time PCR system實(shí)時(shí)定量PCR儀，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為SYBR Green 10 μL，cDNA 2.5 μL，引物0.5 μL，補(bǔ)水至總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，然后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，反應(yīng)完成后，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析，3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白啄瓜Fom-2基因的克隆與序列分析

隨著白啄瓜集約化、規(guī)模化的生產(chǎn)，尤其是設(shè)施白啄瓜的發(fā)展，枯萎病的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重（圖版-A，B），已經(jīng)成為制約白啄瓜安全綠色生產(chǎn)的限制因素。

我們通過(guò)同源克隆方法，從白啄瓜中克隆到了Fom-2基因，cDNA序列的CDS全長(zhǎng)為3 300 bp，推定編碼1 099個(gè)氨基酸，采用http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html在線分析得到FOM-2蛋白的等電點(diǎn)為8.08，分子量為126.96 ku左右（圖版-C）。通過(guò)SMART在線分析，表明FOM-2蛋白存在2個(gè)結(jié)構(gòu)功能域：NB-ARC和SCOP功能域，其中NB-ARC功能域是植物R基因的典型結(jié)構(gòu)功能域，SCOP為富含LRR的結(jié)構(gòu)功能域，對(duì)NBS-LRR類R基因的功能十分重要（圖版-C，D）。

2.2 白啄瓜Fom-2基因編碼蛋白分析

采用ProtScale在線分析（http://www.expasy.org/tools/protscale.html）表明，F(xiàn)OM-2蛋白具有多個(gè)高疏水性和親水性區(qū)域（圖版-E）。通過(guò)SWISS-MODEL分析表明FOM-2蛋白具有典型螺旋及折疊結(jié)構(gòu)，含有一個(gè)可能的CC區(qū)域，可能屬于CC-NBS-LRR類型R基因（圖版-F）。

基于白啄瓜推定的氨基酸序列及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中典型的R基因序列，采用MEG4.0軟件已鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，表明白啄瓜Fom-2基因與其他物種的NBS-LRR類R基因同源性較高（圖1）。

2.3 枯萎病接種后白啄瓜Fom-2基因的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)白啄瓜Fom-2基因的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，白啄瓜Fom-2基因在經(jīng)甜瓜枯萎病生理小種1接種后表達(dá)明顯上調(diào)，接種后表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照水平上升7倍左右（圖2）。

3 討 論

抗枯萎病育種是甜瓜等瓜類作物的主要育種目標(biāo)之一，枯萎病抗性基因的克隆為抗病分子育種提供依據(jù)。高等植物中廣泛存在相對(duì)保守的植物抗病基因R基因，其中NBS-LRR（nucleotide binding site-leucine rich repeat）類R基因是數(shù)量最多的一類含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)及富含亮氨酸重復(fù)的胞內(nèi)受體蛋白[8]。模式植物擬南芥基因組中大約有200個(gè)左右的R基因類似序列，但功能已知的只有少數(shù)十幾個(gè)[9]。本研究通過(guò)同源克隆方法從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了抗甜瓜枯萎病生理小種0和1的Fom-2基因的同源基因，從白啄瓜中克隆到的Fom-2基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的NBS-LRR類R基因具有較高同源性，為典型的NBS-LRR類R基因，具有R基因的2個(gè)結(jié)構(gòu)功能域NB-ARC及富含LRR域的SCOP結(jié)構(gòu)功能域[8]。目前認(rèn)為，LRR區(qū)域?yàn)椴≡奶禺愖R(shí)別區(qū)域，單核苷酸改變都有可能影響到病原菌的專性識(shí)別，LRR區(qū)域的專性識(shí)別機(jī)制是植物抗病基因與病原菌協(xié)同進(jìn)化選擇的結(jié)果[10]。我們同時(shí)也對(duì)不同甜瓜變種或栽培種的Fom-2基因LRR區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增與分析，發(fā)現(xiàn)了LRR區(qū)域在不同甜瓜變種或栽培種中存在單核苷酸多態(tài)性，我們同時(shí)也根據(jù)這些單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了AS-PCR及CAPS標(biāo)記，用于甜瓜抗枯萎病分子育種輔助選擇[11]。國(guó)內(nèi)有課題組曾從 日本安農(nóng)二號(hào)（Japan annong-2）甜瓜中克隆到了Fom-2基因，同時(shí)也研究了幾個(gè)甜瓜品種中該基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，為甜瓜的抗枯萎病育種提供理論依據(jù)[12-13]。然而，目前Fom-2基因介導(dǎo)甜瓜抗甜瓜枯萎病生理小種0和1的機(jī)制仍不清晰，F(xiàn)OM-2蛋白的生化機(jī)制及LRR區(qū)域單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與基因的功能相關(guān)性研究目前仍需要進(jìn)一步深入。隨著更多甜瓜Fom-2基因的克隆與分析，大大加快了甜瓜抗枯萎病的分子育種進(jìn)程。（本文圖版見(jiàn)插4）

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