38個歐美草莓栽培品種SSR指紋圖譜的構建

摘 要：為了建立草莓品種指紋圖譜數據庫，從而對不同草莓品種進行分子鑒定，以早光、因都卡、達賽萊克特、森加拉等38個歐美草莓栽培品種為試材，利用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行擴增產物檢測。通過對各種影響因素不同濃度梯度的比較，得出優化的SSR擴增反應體系，25 μL PCR的反應體系中各成分為：1×Buffer；2.5 mmol·L-1 MgCl2；0.4 μmol·L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol·L-1 dNTP；60 ng DNA。從44對引物中篩選出帶型清晰、多態性豐富的10條SSR引物。最終確定了4對SSR引物作為核心引物對38個草莓品種進行了分子圖譜的構建，29個草莓品種可以完全與其他品種區分開。

關鍵詞： 草莓； 指紋圖譜； 分子標記； SSR

中圖分類號：Ｓ６６8．4 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1032－０6

Establishment of SSR fingerprinting database for 38 cultivars of strawberry (Fragaria ananassa) native to Europe and America

WANG Zhuang-wei，ZHAO Mi-zhen， YUAN Ji，WU Wei-min， QIAN Ya-ming

（Institute of Horticulture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014 China）

Abstract: The total DNA of 38 strawberry cultivars originating in Europe and America ，such as Earliglow， Induka， Darselect ，Senga， Litessa， were amplified by 44 pairs of SSR primers. The PCR products were separated in 8% polyacrylamide sequencing gels. Some factors which affected amplified products，such as dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and so on were also studied. Optimum condition was as follows：25 μL PCR reaction system consisted of 1×PCR Buffer， 2.5 mmol·L-1 MgCl2， 0.4 μmol primer， 0.2 mmol dNTP， 1.5 U Taq polymerase and 60 ng DNA. The amplification conditions were 94 ℃ for 1 min，35 cycles of 94 ℃ for 30 s，annealing temperature for 30 s ，72 ℃ for 30 s and a final extension step at 72 ℃ for 7 min． Ten pairs of primers which could amplify stable and distinct band were selected. The electrophoresis results of the 38 strawberry DNA samples were evaluated and analyzed. Eventually， 29 cultivars could be distinguished by the fingerprint map constructed by only 4 pairs of SSR primers．

Key words: Strawberry； Fingerprinting； Molecular marker； SSR

草莓在世界上廣泛種植，是重要的經濟果樹。全世界草莓屬約20個種，2 000多個品種。草莓通過匍匐莖營養繁殖，容易造成種質資源圃或育苗地品種混雜。長期以來，人們主要根據形態特征來鑒定區分草莓品種。草莓育種往往集中利用少數優良親本，遺傳基礎狹窄，栽培草莓多為八倍體，眾多農藝性狀為數量性狀，且草莓的植物學性狀易受環境、栽培、氣候等影響，傳統的形態學方法常常難以區分相近的草莓品種[1-2]，品種的純度及品種權保護需要可靠的種質鑒定方法。

近年來，分子生物學技術發展迅速，它具有快捷、簡便的特點，極大彌補了傳統方法的缺陷，日益成為品種注冊登記、品種權保護和解決種苗糾紛的重要依據，涉及到RFLP、RAPD、AFLP及SSR等不同類型的標記[3-6]。RFLP技術多態性表現穩定，但需經酶切、DNA分子雜交、放射自顯影等過程，步驟繁瑣而費時，而且在草莓種間特別是與栽培品種關系最密切的多倍體種間RFLP多態性很低[7]。RAPD具有快速、簡便、多態性豐富的特點，因而已成為至今草莓上研究應用最多的分子標記。但RAPD-PCR技術對試驗條件控制要求較高，標記穩定性較差，重復性欠佳，且在八倍體草莓中擴增還存在劑量效應，擴增帶的出現與該位點在基因型中的拷貝數有關，給實際應用帶來一定困難[2，8]。AFLP多態性豐富可以很好地區分鑒定草莓品種，但AFLP技術對DNA提取質量要求很嚴格，在草莓不同生長階段或者不同組織提取的DNA難以獲得重復性結果[9]。且八倍體栽培草莓品種多為雜合體，而RAPD和AFLP都非共顯性標記，難以檢測位點的純合與雜合[2]。

SSR標記，是一類由幾個核苷酸（一般為2~5 bp）為重復單位組成的簡單串聯重復序列，其重復次數在物種間、品種間甚至個體間具有非常大的變異性，很多作物的研究表明，SSR標記分布于整個基因組，具有數量豐富，等位變異高，共顯性，檢測簡單，結果穩定可靠等優點，得到了廣泛應用[10-11]。多倍體草莓中顯性標記呈現劑量效應，SSR穩定性好且呈共顯性遺傳，作為草莓分子標記技術方法更為理想[2]。近年來草莓SSR引物數據不斷增加，得到廣泛的研究應用。

近年來，國外科研工作者開發了大量的草莓SSR引物，并已應用于遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建等方面[1，12-13]。但國內還未見草莓SSR分子標記的研究報道，指紋圖譜構建的研究也很少。我們以栽培品種為試材，建立了草莓SSR-PCR反應體系，并利用SSR標記建立了草莓38個歐美品種指紋圖譜數據庫，以期為鑒定品種，保證品種的真實性和純度，維護生產者和育種家的利益奠定基礎，并為進行草莓種質的指紋圖譜鑒定和數據管理提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試品種加拿大、因都卡、達賽萊克特、森加拉等38個歐美草莓種質均取自江蘇省農業科學院國家果樹種質南京桃草莓圃（表1）。

1.1.2 試劑及設備 TaqDNA聚合酶、dNTP等購于MBI Fermentas公司， 常規試劑均為分析純。PCR反應在德國生產的Biometra T1上進行，離心機使用BACKMAN X-22R。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 參考陳大明等[14]方法，略作修改，提取草莓葉片基因組DNA并進行DNA樣品的濃度和純度的測定，將DNA樣品稀釋至10 mg·L-1備用。

1.2.2 引物合成 根據參考文獻[15-16]，選擇了來自草莓屬的44對SSR引物，由英駿生命技術有限公司合成（表2）。

1.2.3 SSR-PCR擴增 （1）PCR反應體系。為獲得穩定可靠的試驗結果，在25 μL反應體系中對各個成分進行優化，以期最終確定PCR的最佳反應體系。（2）PCR反應程序。 94 ℃預變性1 min；94 ℃ 30 s，Ta 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環；最后72 ℃延伸7 min，擴增產物4 ℃保存待電泳檢測。

1.2.4 PCR產物的檢測 采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物，電泳后銀染染色。 1.2.5 引物篩選及指紋圖譜的構建 利用白燈箱觀察電泳結果，進行數據統計并拍照。從44對引物中篩選出條帶清晰、擴增結果穩定的引物對品種進行試驗，根據組合鑒別結果確定核心引物構建指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 草莓SSR反應體系的建立

由圖1可知，dNTP濃度從0.15～0.4 mmol·L-1 5個濃度梯度中均得到相同擴增產物，但相比之下，當dNTP用量為0.2 mmol·L-1 時，可以得到理想的擴增效果，因此，確定dNTP適宜用量為0.2 mmol·L-1 ；隨著引物濃度的增加，擴增條帶亮度增加，濃度為0.2 mmol·L-1 時，條帶很弱，濃度為0.5 mmol·L-1 時可能是引物過量引起引物與模板非特異性配對增加，濃度在0.3～0.4 mmol·L-1 時，擴增結果條帶清晰，基本一致，確定引物適宜用量為0.4 mmol·L-1 ；隨著Mg2+濃度的增加，擴增條帶逐漸加深，當Mg2+濃度為3.0 mmol·L-1 時，擴增的特異性降低，條帶產生彌散現象。選用條帶最清晰2.5 mmol·L-1 為適宜濃度。由圖2可知，當Taq酶濃度在0.5～1.5 U時，擴增帶清晰一致，濃度為2.0、2.5 U時，擴增帶有彌散現象，背景模糊，不易觀察，故選用1.5 U為適宜濃度。DNA濃度為10、20 ng時，擴增帶較淺；濃度為80 ng時，擴增帶彌散不清；濃度為40、60 ng時條帶清晰，60 ng的條帶最為清晰，故確定60 ng為最佳濃度。最終確定25 μL PCR的反應體系中各成分為： 1×Buffer；2.5 mmol·L-1 MgCl2；0.4 μmol·L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol·L-1 dNTP；60 ng DNA。

2.2 SSR引物的篩選

利用44對SSR引物，對10個隨機試驗樣本進行SSR-PCR擴增分析。44對SSR引物擴增結果的多態性水平有較大差異，條帶數最少為3條，最多的達到19條，片段大小為93～298 bp。從中篩選了擴增帶型穩定、多態性豐富、重復性較好、帶型清晰的P7、 P16、 P18、 P19、 P20、 P22 、P26 、P33、 P34、 P35 10對引物（表3），對38份草莓品種正式進行SSR-PCR擴增分析。

2.3 DNA指紋圖譜的構建

從10對引物的擴增結果看，10對引物都能將38份品種區分為幾個類型，但單一引物都無法區分所有品種。6、15與27；11與35；13與25；26與31；10對引物擴增結果的帶型都相同，無法相互區分開來。根據10對引物擴增的組合鑒別結果，最終確定了P18、P22、P33 、P35 4對SSR引物為本研究的核心引物，進行DNA指紋圖譜的構建。

根據引物P18的擴增結果，品種2、14、16、17、23、30、37具有特異性帶型，可以與其他品種區分開，品種1、3、6、15、18、27、28、32、34、38帶型相同，品種8、9、10、19、24帶型相同，品種12、22帶型相同，品種4、21、33帶型相同，品種5、20帶型相同，品種7、29帶型相同，品種11、35、36帶型相同，13、25帶型相同，品種26、31帶型相同（圖3）。

根據引物P22的擴增結果，品種17具有特異性帶，可以與其他品種區分開，品種2、5、11、16、35帶型相同，4、8、12、19、22、23、32帶型相同，13、25帶型相同，9、24、33帶型相同，10、36帶型相同，1、3、6、7、14、15、18、20、21、26、27、28、29、30、31、34、37、38帶型相同（圖4）。

根據引物P33的擴增結果，品種37具有特異性帶型，可以與其他品種區分開，品種2、3帶型相同，品種1、4、6、8、13、15、19、22、23、24、25、27、30、32、33帶型相同，品種7、9、16、18、20、29、34、36帶型相同，品種5、10、11、12、14、21、26、31、35、38帶型相同，品種17、28帶型相同（圖5）。

根據引物P35的擴增結果，1、2、7、12、34、37具有特異性帶型，可以與其他品種區分開，品種3、4、5、9、13、14、16、17、18、19、20、21、23、24、25、33、36帶型相同，品種6、15、22、27、28帶型相同，品種8、10、11、26、29、30、31、32、35、38帶型相同（圖6）。

由4個核心引物擴增條帶的組合鑒別結果看，6、15與27為一類；11與35為一類；13與25為一類；26與31為一類；其他29個品種都可以根據4個引物的擴增結果相互區分開來，建立有效的指紋圖譜。

3 討 論

從研究SSR-PCR體系的優化過程可知SSR對反應條件要求不嚴格，各反應成分均具有較大的適宜范圍，大多數都能擴增出穩定清晰的帶型；在體系優化、引物最初篩選、指紋構建3個過程中，同一引物擴增結果一致，表明SSR標記結果穩定、重復性高。SSR分子標記操作過程經濟實用，簡單便捷，準確可靠，對試驗要求不高。國際植物新品種保護聯盟（UPOV）已將SSR標記技術和單核苷酸多態性技術（SNP）推薦為適合構建指紋圖譜數據庫的兩種技術，認為SSR標記技術是目前最為成熟的技術[17]。

RAPD、AFLP、SSR等分子標記手段在國外已成功地用于指紋圖譜和品種鑒別[18-20]，我國草莓分子標記方面的研究起步較晚，研究報道不多，主要是利用RAPD和AFLP技術手段進行親緣關系分析或雜種的鑒定[21-23]，草莓SSR分子標記及指紋圖譜構建研究很少。本研究應用SSR技術，初步構建了草莓基因組DNA指紋圖譜構建的技術體系，最終利用4對SSR引物能完全區分親緣關系較近的29個歐美品種，為草莓DNA指紋圖譜的構建奠定了基礎。SSR標記技術還可以利用多個引物進行多重PCR擴增，這將可以大大節省時間和成本，該技術在國外已有成功報道[1]，本單位將進一步優化建立多重SSR標記技術。

本研究中的歐美草莓品種材料采自國家草莓種質資源圃，最初來源都是國內各單位從國外引入，在草莓引種過程中，由于引種單位不同，或引種地區不同，或最初引種記錄不詳等原因，造成一些品種名稱、來源等資料不詳或不準確，存在同物異名和同名異物的情況。在本研究中，維斯托爾、S1和里瓦；加拿大四季和波波拉特卡；加拿大和MSU4359；早光和B2；用篩選的條帶清晰多態性好的10對引物都未能區分開來，該結果有可能是因為親緣關系很近難以區分，亦有可能是因為引種過程中造成的同物異名，這還需篩選更多的SSR引物進一步擴增驗證，或結合其他分子標記手段，并根據植株形態特征來進一步驗證。

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