草莓NBS-LRR家族基因FaNBS1的克隆與表達分析

摘 要：利用同源克隆結合RACE技術從久香草莓莖尖cDNA中分離到一個抗病相關TIR-NBS-LRR類基因FaNBS1 （GenBank登錄號：HQ845018），解析了該基因及其編碼蛋白的組織結構和同源特征；并采用半定量RT-PCR技術分析了該基因在不同組織中的表達差異和外源植物生長物質處理下的表達變化。該基因在基因組上長為2 434 bp， 由3個外顯子組成的轉錄本包含長1 893 bp的讀碼框。所編碼蛋白含630個氨基酸殘基，在15~146是保守的TIR結構域，191~492是NB-ARC結構域。FaNBS1與大豆TIR-NBS-LRR抗性蛋白ADF78118的全序列一致性為50.20%，在NB-ARC保守結構域的一致性為52.06%。半定量RT-PCR分析顯示，FaNBS1在檢測的所有組織中都表達，但在莖尖分生組織中表達水平最高，且在葉中的表達水平明顯受到外源水楊酸和脫落酸處理的影響。

關鍵詞： 草莓； NBS-LRR基因； 同源克?。?基因結構； 進化樹； RT-PCR

中圖分類號：Ｓ６６8．4 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1025－０7

Cloning and expression analysis of a NBS-LRR family gene from strawberry （Fragaria × ananassa）

LIU Jian-cheng1，2，3， DUAN Ke2， LI Jing3， YE Zheng-wen3， SU Jian-yu1*，GAO Qing-hua3*

（1College of Life Sciences， Ningxia University， Yinchuan，Ningxia 750021 China； 2Institute of Biotechnology， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 201106 China； 3Forestry and Fruit Research Institute of Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology， Shanghai 201403 China）

Abstract: Homologous cloning combined with the RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique was used to isolate the disease resistance related gene FaNBS1 (Accession No.: HQ845018) from shoot apical meristems of Fragaria × ananassa Duch. cv. Jiuxiang. After characterizing the exon-intron organization of FaNBS1， modular structure and homology of its deduced protein， semi-quantitative RT-PCR was performed to study its expression pattern in different tissues and responses to external plant growth regulators. The genomic sequence for FaNBS1 is 2 434-bp-long， consisting of 3 exons. This gene harbors a 1 893 bp open reading frame (ORF) encoding a 630 amino acid peptide， with a TIR domain (amino acids 15 to 146) at the N terminal and a NB-ARC domain in the middle region (amino acids 191 to 492). The deduced amino acid sequence showed the highest similarity to TIR-NBS-LRR disease resistance protein ADF78118 from Glycine max， with 50.20% identity in whole sequence and 52.06% identity in NB-ARC domain. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that this gene expressed in all tissues tested， but the expression level was the highest in shoot apical meristem and was significantly affected by salicylic acid and abscisic acid in leaves.

Key words: Fragaria× ananassa Duch. cv. Jiuxiang； NBS-LRR disease resistance gene； Homologous cloning； Gene organization； Phylogenetic tree； RT-PCR

草莓屬于薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）水果，聯合國糧農組織（FAO）統計數據表明其生產和進出口貿易額均居全球十大水果之列[1]。目前，我國草莓的栽培面積和產量均居世界第1位，分別在13.3萬hm2和200多萬t左右（2010年全國草莓大會數據）。近年來，因草莓白粉病、炭疽病、灰霉病等病害引起的草莓產量不穩、果品質量下降，已經成為影響草莓持續穩定發展的主要限制因子。目前，我國對草莓病害的分子水平研究還處于初期。在我國草莓的育種實踐中，一些較新的育種技術手段還沒有應用在抗病育種實踐中，特別是病害相關分子標記與基因的發掘和功能研究。

植物缺乏如脊椎動物賴以響應病原的適應性免疫能力，因此要成功地感受并抵御病害，植物必須依賴基因組中穩定編碼的抗病相關基因[2]。具有核酸結合位點并富含亮氨酸重復結構域的NBS-LRR植物蛋白編碼基因是非常重要且成員最多的一類抗病基因[3]。一些NBS-LRR蛋白直接結合病原蛋白，另一些植物NBS-LRR 蛋白間接感受病原毒性蛋白[4]。如玉米Hm1基因，它編碼的NBS-LRR 蛋白能鈍化病原菌侵染時產生的毒素，進而抑制病原菌的擴展和定植，使植物局部發生壞死現象。擬南芥抗青枯病基因RRS1編碼的蛋白通過N端的LRR識別并結合病原菌無毒蛋白PopP2，導致C端WRKY轉錄因子結構域的活化，進一步激活了下游信號的傳導，或直接激活防御基因的表達，植物最終表現出抗性[5]。NBS-LRR蛋白編碼基因的克隆是深入了解植物抗病機制和利用基因工程進行植物遺傳改良的基礎，對于作物抗性育種具有重要的指導意義。目前，已有多種植物NBS-LRR抗病基因成功克隆并解析了其功能，果樹方面相關的報道如荔枝、龍眼、蘆柑、柚子中檢測到NBS-LRR基因片段[6]、桃中擴增到4個NBS-LRR類基因片段[7]、香蕉中擴增到一個受水楊酸誘導的NBS-LRR基因片段[8]、梨中克隆到一個受黑星病誘導的NBS-LRR類基因[9]。

早在2004年就有草莓基因組中NBS-LRR類基因片段鑒定的報道[10]，但迄今沒有從草莓中分離完整NBS-LRR類基因的相關報道。本研究應用同源克隆策略結合RACE技術，從草莓中分離了第1個完整的NBS-LRR基因FaNBS1（Accession No.: HQ845018），并發現外源水楊酸和脫落酸處理顯著影響了該基因在葉中的表達。

1 材料和方法

1.1 植物材料

久香草莓（Fragaria×ananassa Duch. cv. Jiuxiang）葉片及其他各種類型組織均采自上海農科院林木果樹研究所草莓種質資源圃。SA、ABA、MeJA處理濃度分別為10-3、10-5、5×10-4 mol·L-1， 處理后在不同時間取久香草莓葉片液氮速凍，用于RNA提取和基因表達分析。

1.2 方法

1.2.1 草莓RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 按照改良CTAB法[11] 提取草莓各種組織的總RNA之后， 采用1% agarose gel電泳結合Nanodrop ND-1000分光光度計（Thermo Scientific， Wilmington， USA） 比色分析來確定RNA的質量和濃度。

反轉錄合成cDNA前， 首先在25 μL反應體系中使用2.5 μLDNaseI （Fermentas， Cat.EN0521）消解4 μg RNA樣品以除去基因組DNA的污染。37 ℃反應30 min后， 加入2.5 μL EDTA 在65 ℃反應5 min使酶失活，之后加入dNTP和Oligo-dT各2 μL。 接著，在以上體系中再添加M-MLV反轉錄酶（Promega， Cat.M170A）及相應buffer，并以ddH2O補足體系至40 μL， 混勻后42 ℃反應1 h， 70 ℃處理5 min終止反應。直接以原液2~3 μL作模板， 采用高保真DNA聚合酶用于全長基因擴增；反轉錄產物稀釋10倍取2 μL作模板，采用普通DNA聚合酶用于RT-PCR。

1.2.2 同源克隆結合RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術分離全長基因 根據NCBI中已有草莓抗病相關NBS-LRR類基因片段信息，經RT-PCR確認真實表達后，利用5’-Full RACE Kit （Takara， Dalian， Cat# D315）和3’-Full RACE Core Set Ver 2.0 （Takara， Dalian， Cat# D314）分離了基因的5’和3’端頭。在計算機上拼接兩向RACE結果和已有中間片段獲得理論序列， 再針對該拼接理論序列設計了跨完整讀碼框含非翻譯區（2 091 bp）的引物一對: NBS-1F: 5’-CCCCCTCAACACCTTTCCT TTTCT-3’和NBS-1R: 5’- CAATCCCTGCGAGACAGAGATGAA -3’。利用高保真DNA 聚合酶TransTaq （HiFi） （TransGen Biotech， Beijing， Cat#AP131-03） 以NBS-1F和NBS-1R引物對在草莓莖尖cDNAs中擴增，將獲得的產物克隆到pEASY-T3載體（TransGen Biotech， Beijing， Cat# CT301-01）后測序， 由此獲得全長目標基因。由于數據庫目前僅有推測的草莓NBS家族基因片段，本研究報道的基因是第1個被證實表達的全長草莓NBS-LRR家族基因，遂被命名為FaNBS1， 在GenBank登錄（Accession No: HQ845018）。

1.2.3 從基因組DNA中擴增分離全長基因 提取草莓基因組DNA，利用高保真DNA 聚合酶Trans Taq （HiFi） （TransGen Biotech， Beijing， Cat#AP131-03） 以NBS-1F和NBS-1R引物對擴增基因組DNA，將獲得的目的產物克隆到pEASY-T3載體（TransGen Biotech， Beijing， Cat# CT301-01） ，篩選陽性克隆進行測序， 獲得全長基因。

1.2.4 基因及其編碼蛋白的結構和同源分析 應用DNAMAN軟件比對全長引物從cDNA中和基因組DNA中擴增產物的不同序列，可獲知基因的外顯子和內含子結構信息。利用基因推定的氨基酸序列，在http://pfam.janelia.org （Washington University）進行模塊分析，根據程序分析結果繪制結構圖。將得到的目標基因核酸序列在http://www.ncbi.nih.gov網站采用BLASTX分析獲得序列一致性較高的同源基因信息。利用Clustal W軟件在http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2 進行序列比對分析，按照鄰接算法構建無根進化樹。

1.2.5 RT-PCR （Reverse Transcript-PCR）方法 半定量RT-PCR在東勝-黑金剛PCR儀上進行。 PCR反應體系為20 μL， 包括10×PCR buffer 2 μL， dNTP 0.5 μL （2.5 mmol·L-1）， 上下游引物各0.2 μL （10 μmol·L-1）， 稀釋10倍的cDNA模板2 μL， Taq DNA polymerase 0.2 μL （5 units·μL-1）， ddH20 15 μL。PCR程序設置為: 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s， 59 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s；28~33個循環。內標采用草莓Actin特異擴增，所用引物為FaActin-U: 5’- TGGCTGTGCACGATGATTGC -3’ 和FaActin-L: 5’- TAACTTCCCACCAGATATCC-3’， 擴增產物長450 bp。目標基因特異引物為NBS-RT1: GATTCTAAAGGAAAGAGAGGT GGAG；NBS-RT2: GCCGAATTCTTTTGAAG GCAATCAC，擴增產物為305 bp。擴增產物用2% agarose gel電泳檢測， Goldview染色， BIO-RAD凝膠成像儀拍照。

Real-Time RT-PCR 試驗采用Takara Perfect Real Time 試劑盒（大連寶生物，DRR041A），PCR體系配制按照試劑盒說明書進行。PCR反應在ABI 7500 Real Time PCR System上進行，程序設置為94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s， 59 ℃ 31 s， 72 ℃ 31s；40個循環。熒光信號數據采集在72 ℃延伸步驟進行，數據的分析利用ABI 7500分析軟件完成。

2 結果與分析

2.1 草莓FaNBS1全長基因的克隆

在前期應用RT-PCR技術檢測草莓中表達的NBS-LRR基因工作中，發現1個在草莓莖尖和葉片中表達水平都較高的NBS-LRR基因?；谶@一基因的RT-PCR產物克?。?80 bp片段），進行了RACE實驗。在5’RACE中，得到1.6 kb左右的片段；在3’RACE中，得到800 bp左右片段。根據兩向RACE結果重疊情況，在計算機上拼接獲得理論的全長序列。針對這一計算機拼接序列，又設計跨越編碼區的全長引物，并從草莓莖尖cDNA中擴增。擴增產物測序結果表明符合預期。圖1顯示，所克隆基因完整的編碼區長1 893 bp， 編碼包含630個氨基酸殘基的蛋白， 蛋白分子量為71.325 ku。由于GenBank尚沒有草莓NBS-LRR類mRNA序列登錄，我們將該基因命名為FaNBS1， 遞交到GenBank， 登錄號為HQ845018。

2.2 草莓FaNBS1基因及編碼蛋白的結構和同源特征

在克隆了FaNBS1包含完整讀碼框的cDNA序列后，我們進一步利用全長引物從久香草莓基因組DNA中擴增了該基因，獲得了1個近2.5 kb片段。經過克隆測序，比對基因組上DNA序列和轉錄的cDNA序列，發現FaNBS1在基因組上長2 434 bp， 包含3個外顯子。圖2-A所示，FaNBS1由3個長度接近的外顯子和2個內含子組成，起始密碼位于127~129 bp， 終止密碼位于2 360~2 362 bp。3個外顯子依次長629 bp、780 bp、682 bp長，2個內含子分別長240 bp和103 bp。完整讀碼框長1 893 bp， 其前后分別存在非編碼區（UTR）， 5’UTR長126 bp， 3’UTR長72 bp。尚未發現FaNBS1基因在外顯子內含子組織情況上和同源基因有相似性。

對于FaNBS1編碼蛋白的模塊組織情況，我們利用華盛頓大學的PFAM軟件進行了分析。結果圖2-B所示，在15~146是Toll/interleukin-1 受體 （TIR） 同源結構域，這是一個具有細胞間信號轉導功能的結構域，在動物中參與調節Toll類受體和相關信號轉導蛋白之間的相互作用[12]。FaNBS1基因編碼蛋白的191~492氨基酸殘基是NB-ARC結構域，該結構域在植物抗性蛋白和動物細胞死亡調節因子中都存在，涉及信號轉導過程[13]。

根據久香草莓FaNBS1基因編碼蛋白的氨基酸序列和其他14個不同植物中NBS-LRR類蛋白的序列，用Clustal W2軟件作比對分析，得到它們的系統進化樹圖。圖3所示，草莓FaNBS1和森林草莓FvNBS1高度同源，它們和大豆ADF78118聚在一個小亞類中。該小亞類又和苜蓿ACF19650、擬南芥AAN86124、梨CAE46514、大麥ACG49264、蓖麻EEF47358和毛果楊EEE85015等6個成員組成一個大類群。森林草莓的FvNBS3和FvNBS11與蘋果ADL36726組成一個小亞類，而葡萄的3個NBS-LRR蛋白XP_002272034、CBI18507和CAN68265單獨聚成另一個亞類，這6個成員之間的同源程度略高，它們和草莓FaNBS1的同源程度更低。

草莓FaNBS1和森林草莓FvNBS1和FvNBS11、大豆ADF78118、葡萄CAN68265、梨CAE46514及大麥ACG49264在氨基酸全序列的一致性分別為90.32%、45.06%、43.58%、41.70%、21.18%和9.29%，在NB-ARC結構域的序列一致性分別為90.24%、48.41%、49.40%、48.00%、21.18%和13.43%。由以上結果可知，除了森林草莓中高度同源的FvNBS1之外，FaNBS1和其他NBS-LRR類蛋白在全序列上保守性不高，在NB-ARC結構域的保守性略有增加。

2.3 草莓FaNBS1基因在不同組織的表達特征分析

半定量RT-PCR實驗顯示（圖4），FaNBS1表達范圍很廣，在所分析的各種組織器官中都檢測到其轉錄產物的積累。表達范圍涵蓋了多種營養生長器官和生殖生長器官，包括根、莖、葉、花和果實等均有表達；其中以匍匐莖中表達水平最低，莖尖分生組織表達水平最高，葉片和根中表達水平也較高。此外，該基因在花、綠色幼嫩的草莓果實和完全成熟紅色果實中表達水平比較一致，略低于根和葉中。

2.4 草莓FaNBS1基因表達對外源水楊酸、脫落酸和茉莉酸甲酯的響應

利用植物抗性相關的外源植物生長物質處理實驗，我們分析了FaNBS1基因在轉錄水平上是否響應這些外源生長物質。結果發現，水楊酸SA、脫落酸ABA和茉莉酸甲酯 MeJA處理均能顯著影響FaNBS1基因的表達，但變化模式各不相同。

如圖5所示，10-5 mol·L-1 ABA處理0.25 h（15 min）就引起FaNBS1表達增強，處理0.5 h后基因表達增強至最高水平（為處理前2.1倍），但處理1.5 h后FaNBS1表達水平又下降并接近處理前水平，之后發生波動，到處理20 h基因表達又再次回復到處理前水平。10-3 mol·L-1 SA處理0.25 h到1.5 h期間，基因表達沒有顯著的變化，但處理5 h后表達水平開始上升，到10 h表達略有下降但仍高于處理前，到處理后20 h基因表達水平達到最高，為處理前的2.2倍。在所用的MeJA濃度（10-4 mol·L-1）和分析時間點范圍內，未檢測到FaNBS1表達有變化，但當我們提高MeJA濃度至5×10-4 mol·L-1時，發現茉莉酸甲酯能顯著抑制FaNBS1基因的表達，處理后基因表達盡管有波動，但總體是下降的趨勢，在處理后10 h基因表達下降到最低水平，僅相當于處理前16.43%。

3 討 論

前人在分析草莓抗性基因類似物RGA（resistance gene analogues）時發現，克隆的13個NBS-LRR類RGA中除了GAV-3外，均為TIR類NBS-LRR基因，而從序列分析中推斷non-TIR類的GAV-3極可能屬于假基因[10]。草莓基因組中TIR類和non-TIR類NBS-LRR基因的不均衡分布，可能是草莓特有的遺傳性狀，源于進化中的基因丟失過程[14]。我們在前期利用RT-PCR檢測草莓中表達的NBS-LRR基因中，鑒定到7個不同的草莓NBS-LRR克隆，基于這些片段的序列分析顯示它們都屬于TIR類NBS-LRR基因（待發表）。此處報道的FaNBS1是這7個基因中的一個，獲得完整讀碼框后經分析也進一步確認是TIR類NBS-LRR基因，和前人的觀點相吻合。

脫落酸（ABA）對于植物響應水分、鹽離子等非生物脅迫的重要性早已周知，近年的研究確立了茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）信號途徑分別在抵御生物類脅迫中壞死營養型病原和活體營養型病原中的重要作用[2]。本研究發現，草莓FaNBS1基因在轉錄水平明顯響應了外源ABA、SA和JA處理。要進一步推斷FaNBS1基因是否參與應對非生物脅迫、參與對白粉病（活體營養型病原）以及參與對炭疽病和灰霉?。▔乃罓I養型病原）的抵御，還有待反向遺傳學相關的基因功能研究。

近日森林草莓基因組測序工作的完成，為今后相關的草莓基因功能解析提供了前所未有的良好機遇[15]。進一步克隆FaNBS1的啟動子，進行啟動子驅動GUS報告基因轉基因研究，將為該基因的表達特征的揭示提供重要的信息?；诒狙芯啃〗M已經建立的草莓遺傳轉化體系，我們即將啟動草莓FaNBS1基因的過量表達、RNA干涉轉基因等反向遺傳學研究，預期FaNBS1基因對于草莓適應生物脅迫和非生物脅迫的意義不久將得到揭示。

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