杧果MGAPDH同源基因的克隆及其表達分析

摘 要： 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）是糖代謝和能量代謝過程中的關鍵酶。根據GAPDH基因保守序列設計PCR引物，利用RT-PCR和改良RACE技術，首次從杧果中分離克隆出MGAPDH同源基因的cDNA全長序列。該序列全長為1 356 bp，開放閱讀框為1 203 bp，編碼401個氨基酸。利用分子生物學軟件對MGAPDH蛋白進行生物信息學分析，結果顯示：MGAPDH蛋白分子量為42.8 ku，等電點為8.9；該蛋白包含2個功能域，即NADB_ Rossmann superfamily和Gp_dh_C superfamily；MGAPDH蛋白不含信號肽序列和跨膜結構，是非分泌蛋白， 位于葉綠體中。氨基酸序列進化分析結果顯示，杧果MGAPDH蛋白可能與光合作用有關。半定量分析顯示，杧果MGAPDH同源基因在杧果不同組織中均表達，并且表達水平差異不明顯，說明杧果MGAPDH同源基因可作為杧果基因差異表達的內參基因。

關鍵詞： 杧果； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）； 表達分析； 序列分析

中圖分類號：Ｓ６６7．7 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1019－０6

Molecular cloning and expression analysis of a MGAPDH homologous gene from mango

LUO Cong1， HE Xin-hua1，2*， HU Ying1， TAN Chao1， OU Shi-jin1

（1College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， 530004； 2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab， Nanning， 530007 China）

Abstract: Glyceral-dehyde-3-phosphate dehyrogenase (GAPDH） is a key enzyme in sugar metabolism and energy metabolism. PCR primers were designed by the conserved sequences of GAPDH gene，and a full-length cDNA sequence of MGAPDH homologous gene was firstly cloned from Mango by employing RT-PCR and modified RACE technique. The full-length cDNA is 1 356 bp and contains an ORF with 1 203 bp， corresponding to a deduced protein of 401 amino acids. The results of bioinformatics analysis showed that the estimated molecular weight and isoelectric point of the putative protein were 42.8 ku and 8.9. The protein had two conserved domains， named as NADB_ Rossmann superfamily and Gp_dh_C superfamily. Bioinformatics analysis also indicated that the protein of mango MGAPDH is a non-secreting protein without any signal peptide and transmembrane domain，MGAPDH gene was located in the chloroplast. The phylogenetic analysis based on the sequence of amino acids showed that MGAPDH protein may relative to photosynthesis. Semiquantitative analysis showed that the MGAPDH homologous gene expressed in all tissues of mango， no significant differences in expression levels were founded among the tested tissues; the result indicted that MGAPDH homologous gene may be used as an internal standard for differential gene expression analysis in mango.

Key words: Mango（Mangifera indica）； Glyceral-dehyde-3-phosphate dehyrogenase (GAPDH）； Expression analysis； Sequence analysis

甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （Glyceral-dehyde-3-phosphate dehyrogenase GAPDH） 是維持生命活動最基本的酶之一，是糖代謝和能量代謝過程中的關鍵酶，廣泛存在于所有原核和真核生物中，它是一種多功能蛋白。在哺乳動物中，它具有膜融合與膜轉運活性、微管蛋白成束活性、磷酸化活性、核RNA輸出活性、DNA修復活性和核膜融合活性等，并且它還參與細胞凋亡過程[1]。在植物中，GAPDH與糖酵解、光合作用和抗逆有關。目前報道，高等植物中存在2種不同類型的GAPDH，一類依賴于NAD+，存在于細胞質中，在糖酵解過程中起作用，是糖酵解和糖異生過程中的關鍵酶；另一類以NAPD（H）為輔酶，也可以NAD+為輔酶，存在于葉綠體，是參與卡爾文循環的關鍵酶，與植物光合作用有關[2-3]。此外，該酶在厭氧、熱激、傷害、抗鹽堿以及能量供應中可能發揮著重要作用，是一種重要的抗逆境脅迫基因[4-6]。有研究報道。GAPDH基因在機體不同組織和細胞中表達豐度高且相對穩定，可用作差異表達研究時的內參基因[4，7-8]。

杧果（Mangifera indica）是世界上重要的多年生經濟林果，素有熱帶果王之稱。目前尚未見有關于杧果GAPDH基因方面的研究報道，我們以四季杧（Chok Anand Mango）為材料，利用RT-PCR和改良RACE技術成功獲得了杧果MGAPDH同源基因cDNA全長序列，并對其進行了生物信息學和表達模式分析，旨在為進一步利用生物技術和基因工程手段研究該基因在杧果中的功能以及為杧果其他基因差異表達的研究提供內參基因。

1 材料和方法

1.1 材料

采集廣西大學農學院標本園8 a生四季杧的葉、花、莖和不同發育階段的果實 （葉、花、莖采集時間為2010年8月22日），迅速置于-40 ℃冰箱保存。

1.2 菌株和試劑

PrimeScript逆轉錄酶、TdT、RNase H、pMD18-T vector、dCTP、dNTP購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒、X-Gal、IPTG、氨芐青霉素（Amp）購自上海生工生物工程技術服務有限公司，Dream Taq酶購自Fermentas公司；大腸桿菌JM109菌株、DL 2 000 DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。所有引物均采用Primer5.0軟件設計，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。

1.3 RNA提取和cDNA第1鏈的合成

我們對肖潔凝等[9]提取杧果RNA的方法進行改良，利用改良的SDS法提取四季杧老葉、嫩葉、花、老莖、嫩莖和果實的RNA，利用紫外分光光度計和電泳檢測其濃度和完整性。cDNA第1鏈的合成用PrimeScript逆轉錄酶，逆轉錄引物為AUP1，步驟按說明書進行。

1.4 杧果MGAPDH同源基因全長的克隆

根據GenBank上已有的GAPDH基因保守序列設計上游引物3MGAu1，用引物3MGAu1和3’端下游錨定引物3Side擴增cDNA，獲得杧果MGAPDH同源基因的3’端序列。反應體系為25 μL：第1鏈產物1 μL， dNTP （10 mmol·L-1） 0.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL， DreamTap 0.14 μL， buffer 2.5 μL， 超純水18.86 μL。擴增參數為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，將目的條帶連接到pMD18-T vector載體、轉化大腸桿菌JM109感受態細胞。經PCR驗證的陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

在獲得杧果MGAPDH同源基因3’端序列的基礎上，根據巢式PCR原理，設計兩條下游巢式特異引物5MGApd1和5MGApd2。利用本課題組改良的5’端RACE技術擴增杧果MGAPDH同源基因的5’末端[10]。

1.5 杧果MGAPDH同源基因生物信息學分析

用GenBank Blast 在線軟件分析杧果MGAPDH同源基因與其他植物GAPDH同源基因核苷酸序列同源性；用Bio XM進行氨基酸序列預測；用在線網站計算氨基酸的等電點和蛋白質大?。╤ttp://isoelectric.ovh.org/）；利用Signal P分析蛋白的信號肽序列；利用TMHMM對蛋白質的跨膜結構進行預測；用NCBI網站中的 conserved domain architecture工具對氨基酸序列的結構域進行預測；用3D-JIGSAW對蛋白質的三級結構進行預測分析，用RasMol2.7進行三級結構顯示；用Clusta1W程序將杧果MGAPDH同源基因推導的氨基酸序列與其他物種GAPDH同源基因氨基酸序列進行多重比較，然后用MEGA4.1軟件，選擇連接近鄰算法NJ（Neighbour joining）構建系統進化樹。

1.6 杧果MGAPDH同源基因的表達分析

提取杧果葉、花、莖和果實的RNA，逆轉錄成cDNA，用紫外分光光度計檢測cDNA濃度，把cDNA稀釋為200 ng·μL-1為模板。利用半定量方法檢測杧果MGAPDH同源基因在四季杧不同組織器官中的表達情況。PCR反應體系與杧果MGAPDH同源基因3’端的反應體系相同。PCR擴增參數為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳。

2 結果與分析

2.1 杧果MGAPDH同源基因全長的獲得

以杧果葉cDNA為模板，用引物3MGAu1和3’端下游錨定引物3Side擴增cDNA獲得長度約為800 bp的明亮條帶，經測序比對確認，獲得長為809 bp的杧果MGAPDH同源基因的3’端序列。在獲得基因3’端序列的基礎上，設計了2條巢式特異下游引物（5MGApd1和5MGApd2）用于擴增杧果MGAPDH同源基因的5’端，通過TdT加尾、巢式PCR和降落PCR技術獲得長度約為700 bp的條帶，經測序比對成功獲得了697 bp的杧果GAPDH同源基因的5’末端。 將MGAPDH同源基因的3’端和5’端序列進行拼接，拼接后其長度為1 356 bp，命名為MGAPDH（GenBank登錄號：HQ585994）。

2.2 杧果MGAPDH同源基因的生物信息學分析

利用Bio XM分子生物學軟件對杧果MGAPDH同源基因的氨基酸序列進行推導，發現該基因完整開放閱讀框為1 203 bp，編碼401個氨基酸（圖1），相對分子量為42.8 Ku，理論等電點（pI）為8.9。利用PSORT （http://psort.hgc.jp/）在線軟件對杧果MGAPDH蛋白進行亞細胞定位分析，杧果MGAPDH蛋白被定位在葉綠體中。將杧果MGAPDH基因的氨基酸序列導入NCBI中的conserved domain architecture工具對氨基酸序列的結構域進行預測，通過搜索發現其包含2個保守的結構域，一個是NADB_ Rossmann superfamily， 另一個為Gp_dh_C superfamily（圖版-A）。經Signal P 3.0軟件分析發現杧果MGAPDH蛋白不含信號肽序列，為非分泌性蛋白；經過TMHMM軟件預測顯示杧果MGAPDH蛋白不存在跨膜結構；杧果MGAPDH蛋白的結構域、信號肽和跨膜結構的預測結果與毛竹[7]、怪柳[11]和木欖[12]的GAPDH蛋白預測結果一致。

2.3 杧果MGAPDH蛋白三級建模

用3D-JIGSAW分析軟件對杧果MGAPDH蛋白的三級結構進行建模（圖版-B）。深紅色為α螺旋，黃色表示β折疊，淡藍色表示轉角（Turn），白色表示其他殘基，建模結果表明，杧果MGAPDH蛋白具有12個α螺旋、18個β折疊和多個轉角。

2.4 杧果MGAPDH同源基因氨基酸系統進化分析

將杧果MGAPDH同源基因序列和GenBank中其他物種GAPDH同源基因序列進行同源性比較發現，杧果MGAPDH同源基因的核苷酸序列與其它物種的GAPDH同源基因的核苷酸序列相似系數在74%~83%，其中與葡萄和毛果楊的相似系數最高，達83%。用不同物種GAPDH基因編碼的氨基酸序列構建系統進化樹（圖2），可將不同物種編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因明顯分成兩類。第I類既有部分植物的GAPDH同源基因，也有動物GAPDH同源基因，植物和動物的GAPDH同源基因能聚為一類，說明GAPDH同源基因在進化過程中高度保守；第Ⅱ類全部為植物GAPDH同源基因。杧果MGAPDH同源基因被聚類到第Ⅱ類，與葡萄親緣關系最近。

2.5 杧果MGAPDH同源基因的表達分析

采用半定量RT-PCR法對杧果MGAPDH同源基因進行器官特異性表達分析（圖3），結果表明，杧果GAPDH同源基因在老葉、嫩葉、花（盛花期）、花（末花期）、老莖、 嫩莖、花后20 d果實、花后40 d果實和花后60 d果實組織中均表達，并且表達水平沒有明顯差異，說明杧果MGAPDH同源基因可以作為杧果其他基因差異表達相關研究的內參基因。

3 討 論

甘油醛-3-磷酸脫氫酶存在于許多物種中，在高等植物中存在2種不同類型的甘油醛-3-磷酸脫氫酶。毛果楊有2個GAPDH同源基因，一個由338個氨基酸構成（XM_002318078），另一個由404個氨基酸構成（XM_002321029）；毛竹也有2個GAPDH同源基因，一個由337個氨基酸構成（GU356597）[7]，另一個由402個氨基酸構成（FP100252）。本研究結果顯示，從杧果中只分離克隆到一個杧果MGAPDH基因，編碼401個氨基酸。杧果MGAPDH同源基因與其他物種同源基因的核苷酸同源性分析顯示，杧果MGAPDH同源基因與其他物種的GAPDH同源基因的核苷酸序列相似性在74%~83%，說明GAPDH同源基因在進化過程中相對保守。

試驗結果顯示，編碼2種不同類型的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因明顯分開聚類。對GAPDH同源基因編碼的氨基酸進行統計分析，結果顯示第I類中的GAPDH同源基因編碼337個左右氨基酸；第Ⅱ類中的GAPDH同源基因編碼400個左右氨基酸。毛竹[7]、怪柳[11]、高羊茅[13]、馬鈴薯、陸地棉GAPDH同源基因分別編碼337、341、337、338、336個氨基酸，聚類到第I類中，亞細胞定位顯示這些蛋白均位于細胞質中，說明聚類到第I類中的GAPDH同源基因可能存在于細胞質中，與糖酵解過程有關。木欖[12]、毛果楊、江南卷柏、煙草、蓖麻的GAPDH同源基因分別編碼405、405、402、392、404個氨基酸，聚類到第Ⅱ類中，亞細胞定位顯示這些蛋白均定位于葉綠體中，說明聚類到第Ⅱ類中的GAPDH同源基因可能存在于葉綠體中，與植物的光合作用過程有關。杧果MGAPDH基因編碼401個氨基酸，聚在第Ⅱ類，亞細胞定位顯示其被定位于葉綠體中，說明杧果MGAPDH基因所編碼的蛋白可能參與卡爾文循環，與杧果的光合作用有關。

杧果MGAPDH同源基因半定量分析顯示，其在不同組織器官中的表達水平差異不明顯，因此杧果MGAPDH同源基因可以作為杧果其他基因差異表達相關研究的內參基因。（本文圖版見封3）

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