獼猴桃EST-SSR引物篩選及通用性分析

摘 要：應用SSRHunter軟件對NCBI公共數據庫中的獼猴桃EST序列進行篩查，利用Primer 5.0軟件設計引物并進行篩選，同時對其在部分柑橘類植物的通用性進行分析。以漓江獼猴桃DNA為模板，對所設計的97對EST-SSR引物進行篩選，結果表明其中77對引物能擴增出清晰條帶，有效擴增率為79.38%。隨機選取20對引物對10份獼猴桃資源進行檢測，結果發現有17對引物對所有材料都有擴增產物并呈現出多態性，多態性擴增率為85%。隨機應用20對有效EST-SSR引物對興津、金柑、枳殼、椪柑、酸柚、甜橙、胡柚、尾張、宮川等柑橘類植物基因組DNA進行擴增，結果表明，其中有11對引物在供試材料中有擴增產物，占引物總數的55%；有8對引物的擴增產物具有多態性，擴增率為72.7%。據此，基于獼猴桃EST序列而篩選的SSR引物在柑橘類植物中具有一定的通用性。

關鍵詞： 獼猴桃； EST-SSR； 引物篩選； 柑橘； 通用性

中圖分類號：Ｓ６６3．4 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1111－０6

Mining and transferability analysis of EST-SSR primers in Kiwifruit (Actinidia spp.)

LIAO Jiao， HUANG Chun-hui， GU Qing-qing， QU Xue-yan， XU Xiao-biao*

(College of Agronomy， Jiangxi Agricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045 China)

Abstrat: ESTs of Actinidia in the NCBI database were downloaded and screened by SSRHunter software， the EST-SSR primers were designed by Primer 5.0， and their transferabilities were analyzed in some Citrus plants. The 97 EST-SSR primers which were deigned were mined by using genomic DNA of Actinidia lijiangensis. The results indicated that the 77 pairs of primer showed amplification， accounting for 79.38%. Twenty pairs of primer selected were detected to PCR for DNAs from 10 Actinidia varieties， the 17 primer pairs of the 20 showed amplification and polymorphism， accounting for 85%. The transferability of 20 pairs of EST-SSR primers which were randomly selected was explored in 9 Citrus germplasms (Okitsu， Kumquat， Trifoliate Orange， Ponkan， Sour Pummelo， Sweet Orange， Huyou， Owari， Miyagawa). The results showed that the 11 primer pairs of the 20 tested primers had the amplification， accounting for 55%. And the 8 primer pairs showed polymorphism， accounting for 72.7%. The results revealed that the EST-SSR markers in Actinidia were transferable in some Citrus germplasms.

Key words: Kiwifruit (Actinidia)； EST-SSR； Mining of primers； Citrus； Transferability

簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也叫微衛星（Microsatellites）。與其他分子標記技術相比，SSR標記具有多態信息含量高、共顯性遺傳、技術簡單、重復性好、特異性強等特點[1]，已被應用于蘋果、葡萄、柑橘和果梅等果樹基因組研究中[2-6]。

表達序列標簽（Express Sequence Tags，EST），是指通過cDNA文庫中隨機挑取的克隆進行大規模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長度一般為150～500 bp[7]。近年來大量快速增長的EST數據已成為SSR的重要來源，各種植物中約有1%～5%的EST含有可用于建立標記的SSR[8]。EST-SSR標記具有信息量大，通用性好，開發簡單快捷、費用低等優點，是一種新型簡便、快速有效的分子標記，并被證明有多方面的利用價值和功能性[9-10]。

獼猴桃隸屬于獼猴桃科（Actinidiaceae） 獼猴桃屬（Actinidia Lindl.），為多年生藤本果樹，它是20 世紀人工馴化栽培野生果樹最有成就的四大果種之一[11]。全世界獼猴桃共有75種，約125個分類群（變種或變型）[12]。獼猴桃歷史悠久、分布廣泛，種質資源極為豐富，但對其有關分子生物學的研究卻較為薄弱。引物數量不足制約了SSR標記的發展，因此有必要進一步開發獼猴桃SSR引物。除傳統的基于實驗手段的文庫法、富集法、省略篩庫法和不同物種間共用引物篩選法外，還有用生物信息學手段來設計和開發SSR引物的方法。而后者也是更方便、快捷、開發成本低的手段。目前，公共數據庫中的獼猴桃EST序列為開發新的獼猴桃SSR引物提供了便利。EST作為基因的一部分，EST-SSR側翼序列在物種之間有高度的保守性，其標記也適合在物種間轉移。現在有許多關于不同科或者同科不同屬間物種的SSR標記轉移擴增成功的報道，鄭麗珊等[13]首次對不同綱物種間的SSR標記通用性進行了研究，證明了一物種的SSR分子標記在遺傳背景差異大的植物中也同樣有轉移擴增的能力。引物的通用性和多態性是影響基因組比較作圖研究的基礎，SSR標記目前只在擬南芥、水稻等少數模式作物中得到大量開發[14]。為了以較少的投入，獲得較多的遺傳信息，我們嘗試進行獼猴桃EST-SSR引物在柑橘類作物中的通用性研究，為柑橘類作物繼續深入開展研究提供便利，對于柑橘類作物基因組學研究，尤其是構建高密度遺傳圖譜及種質資源的收集、保存和評價都具有重要意義。我們通過篩查獼猴桃EST序列數據庫，發掘SSR位點，設計SSR位點兩側的特異引物，并對所設計的引物進行有效性及多態性檢測，同時檢測其在柑橘類植物的通用性，為后續分子生物學的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用材料為棕毛獼猴桃（Actinida fulvicome）、長葉獼猴桃（A. hemsleyana）、狗棗獼猴桃（A. kolomikta）、四萼獼猴桃（A. tetramera）、大籽獼猴桃（A. macrosperma var. macrosperma）、漓江獼猴桃（A. lijiangensis）、網脈獼猴桃（A. cylindrica var. reticulata）、闊葉獼猴桃（A. latifolia var. latifolia）、對萼獼猴桃（A. valvata var. valvata）及粗葉獼猴桃（A. glaucophylla var. robusta）10個獼猴桃種類的幼葉，采自中國科學院武漢植物研究所獼猴桃種質資源圃。引物通用性所用試驗材料為興津（Okitsu）、金柑（Kumquats）、枳殼（Trifoliate Orange）、椪柑（Ponkan）、酸柚（Sour Pummelo）、甜橙（Sweet Orange）、胡柚（Huyou Pummelo）、尾張（Owari）、宮川（Miyagawa），采自江西農業大學農業科技園。

1.2 DNA提取

田間采樣攜帶硅膠，每份材料采4~5片幼葉，用硅膠干燥保存。DNA的提取采用CTAB法[11]并加以改進。

1.3 EST序列搜索

在NCBI dbEST數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.heml）中，以Actinidia為關鍵詞搜索EST序列。在“Display”下拉框中，選擇輸出格式為FASTA，在“send to”下拉框中，選擇輸出方式為File，下載所有中華獼猴桃EST序列，保存至本地電腦備用。

1.4 EST序列處理及搜索SSR位點

采用EST-trimmer程序去除小于100 bp的低質量片段，在剩余無冗余的EST序列中，隨機抽取其中56 400條序列，用SSRHunter1.3軟件進行SSR位點搜索。搜索的標準是：7次以上重復的雙堿基序列，5次以上重復的三堿基序列，4次以上重復的四堿基序列和3次以上重復的五堿基序列與六堿基序列。

1.5 引物設計

從獲取的EST序列中，利用Primer5.0軟件設計引物，選擇的標準是：10次以上重復的雙堿基重復序列，7次以上重復的三堿基序列，5次以上重復的四堿基序列和五堿基序列及4次以上重復的六堿基序列。引物長度在18~24 bp，Tm值控制在58 ℃左右，盡量避免二級結構，產物長度控制在125~300 bp。引物由上海杰瑞合成。共設計97對引物。

1.6 EST-SSR擴增

PCR反應體系為20 μL，各成份用量分別為：Mg2+ 2.0 mmol·L-1；dNTP 0.25 mmol·L-1 ；引物0.3 μmol·L-1；DNA 60 ng；Taq DNA酶1 U。反應程序為：94 ℃預變性180 s，然后進入循環，94 ℃變性30 s，45~60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環。72 ℃延伸240 s，最后于4 ℃保存。

1.7 PCR產物檢測

獼猴桃PCR產物用6%丙烯酰胺凝膠檢測，銀染步驟參照Brant等[15]的方法略作改進。通用性PCR產物檢測用2.5%瓊脂糖凝膠。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃EST序列中SSR的頻率及特性

對來源于獼猴桃EST數據庫（NCBI dbEST）的56 400條單一基因序列使用SSRHunter進行了簡單序列重復SSRs搜索。結果表明，獼猴桃EST-SSR類型豐富，但頻率各不相同。從中共獲得含SSR的EST序列7 939條，其中包括二核苷酸重復5 131條，三核苷酸重復1 237條，四核苷酸重復284條，五核苷酸重復397條，六核苷酸重復890條，分別占總SSR的64.63%、15.58%、3.58%、5.00%和11.21%。其中，二核苷酸重復是最豐富的重復單元，其次為三核苷酸重復和六核苷酸重復。在所獲得的SSR重復單元中，AG/CT為優勢重復，共分布4 654條，占二核苷酸重復中各重復基元的90.70%。其次是AT/AT重復，共分布286條，占二核苷酸重復中各重復基元的5.57%。

在三苷核酸中，最為豐富的3種重復基元是ACC/GGT，AAG/CTT和CGC/GCG，共分布817條，它們占三核苷酸重復中各重復基元的66.04%。其他基元包括AGG/CCT、AGC/GCT、AAC/GTT、ATC/GAT、AGT/ACT、CGA/TCG、AAT/ATT等7種重復基元，共420條SSR序列，占33.96%。在所分析的序列中未見AGT與CGT重復基元。

2.2 引物有效性檢測

以漓江獼猴桃為模板對引物進行篩選。在97對引物中，有77對引物能擴增出清晰條帶，有效擴增率為79.38%。其余引物通過再次優化反應體系均無擴增產物。用20對在漓江獼猴桃中能擴增出清晰條帶的引物對10個獼猴桃種類進行了測試，發現17對引物對所有材料都有擴增產物，引物的擴增效率為85%。且有擴增產物的17對引物在所檢測的10個獼猴桃種類間均能擴增出多態性，多態性擴增率為100%（表1）。

2.3 引物對柑橘類植物的通用性檢測

20對EST-SSR引物中，有11對引物（Acd01、Acd03、Acd04、Acd07、Acd12、Ad001、Ad002、Ad010、Ad048、Ad049、Ad035）在柑橘類植物中都有擴增產物，占引物總數的55%，有8對引物（Acd01、Acd03、Acd04、 Acd07、Acd12、Ad002、 Ad010、Ad001）的擴增產物具有多態性，多態性擴增率為72.7%，占總引物的40%。

引物在柑橘類植物中的擴增產物與在獼猴桃中的擴增產物大小不一致，絕大多數引物除擴增出預期的片段外，都同時出現了比預期產物大的片段（表2）。引物Acd04、Acd07在柑橘類植物中的擴增產物為預期大小片段，引物Acd01、Acd03、Acd12、Ad010及Ad001的擴增產物包含預期大小片段和非預期大小片段，引物Ad002的擴增產物為非預期大小片段。其余9對引物不能在供試材料中擴增。圖1為引物Ad035、Acd03、Ad048及Ad010的擴增圖。引物Ad035及引物Ad048在9份供試柑橘類植物種質中擴增出單一條帶，且均無差異。引物Acd03的擴增條帶最多，100~600 bp均有分布。引物Ad010檢測出3種基因型，在金柑中擴增出獨有的條帶（300~400 bp），在枳殼、椪柑、酸柚、甜橙、胡柚中為單一的同大小片段（500 bp左右），而溫州蜜柑早熟品種興津、宮川與中熟品種尾張的基因型一致。研究結果表明，基于中華獼猴桃EST序列而建立的EST-SSR標記在柑橘類植物中也具有一定的通用性，這對于獼猴桃的比較基因組學研究也具有重要的利用價值。

3 討 論

根據EST序列設計SSR引物是較方便、快捷、開發成本低的手段，較多人進行了實踐。李華盛等[16]合成25對棉花EST-SSR引物，其中有24對引物有擴增產物，17對引物的擴增條帶比較清晰。胥猛等[17]設計了176對鵝掌楸EST-SSR引物，有132對引物有擴增產物。林范學等[18]設計了51對香菇EST-SSR引物，有39對引物有特異性擴增產物，有效擴增率為76.47%。劉公秉等[19]根據松樹的EST序列設計出135對引物，有51對可擴增，擴增率為37.78%，其中有39對引物表現出多態性，多態性擴增率為28.89%。本實驗設計了97對獼猴桃EST-SSR引物，有77對引物能擴增出清晰條帶，有效擴增率為79.38%，擴增率相對較高。但在20對有效引物中，只有17對引物在10份獼猴桃種質均有擴增產物，其余3對引物只能在部分獼猴桃種質中擴增。可能是測試的材料增多，它們之間的遺傳變異也增大。加上所用引物是根據獼猴桃中的獼猴的EST序列來設計的，EST序列具有保守性，并不能在所有的獼猴桃種中都有擴增產物。在所有材料中都有擴增產物的17對引物均能擴增出多態性，所研究的材料屬不同種，具有很好的遺傳多樣性，而引物設計時也選用了SSR重復次數較高的EST，這就增大了引物在不同材料間的多態性擴增率。

基因組SSR的擴增多態性較高，而來自EST的SSR擴增多態性低，但EST-SSR引物開發成本低、效率高，由于其來源于基因表達序列，信息含量豐富，且側翼序列的保守程度和SSR進化的穩定性決定著同一種EST-SSR引物在不同物種間的通用性。因此，EST標記適用于遠緣物種間比較基因組研究。對缺少DNA序列的物種，來源于其他種的EST-SSR標記是有效和可用的資源。

本研究用20對基于獼猴桃EST序列設計的SSR引物，對柑橘部分種與品種間進行擴增，研究結果顯示，55%的引物在柑橘類植物中有擴增產物，且有8對引物擴增出多態性。前人在其他植物的EST-SSR引物通用性方面做了研究，如李宏偉等[20]根據小麥ESTs 設計的597對EST-SSRs 引物在小麥、玉米、水稻和大豆中的有效擴增比率分別為80 %、65.8 %、62.1 %和58.1 %，其中，255 對EST-SSRs 引物（42.7%） 在4種作物中都能獲得預期產物；Holton等[21]的研究表明，大麥EST-SSR標記對小麥通用性達55%；Gupta等[22]的研究結果顯示，40.68%以上的小麥EST-SSR引物能夠在大麥、燕麥、黑麥、水稻和玉米中具有通用性；高羊茅的EST-SSR引物在水稻和小麥中的擴增率分別為59%和71%[23]。在美鵝掌楸中表現多態的66對EST-SSR引物有85%的引物在中國馬褂木中有擴增，54%在白玉蘭中有擴增[17]。相對于前人的研究，本試驗檢測的引物通用性擴增率并不高，為55%，但仍能證明由獼猴桃EST序列而建立的SSR標記對柑橘類植物具有通用性。本試驗中引物的通用性僅是通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，而瓊脂糖電泳只能區分分子量相差較大的片段。因此，如采用分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳，呈現的多態性水平將會更高。

近年來，國際公共數據庫中獼猴桃的ESTs數據日益增多，這些快速增長的ESTs數據為EST-SSR引物的開發提供了寶貴的數據資源。從EST數據庫中開發的這些引物勢必對獼猴桃遺傳圖譜的構建、基因定位、比較基因組學以及重要基因篩選與發掘等領域產生重大影響。而本試驗研究獼猴桃EST-SSR引物在柑橘屬物種間的通用性，亦為柑橘類植物標記開發提供了新的途徑，也使物種間比較圖譜的繪制更為便捷。

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