重組ALA合酶基因(YHem1)轉化草莓提高葉片光合能量轉化能力的效應

摘 要：為了培育高光合抗逆草莓新品種，以紅頰草莓試管苗葉片為外植體，研究了植物生長調節劑對草莓葉片再生的影響，然后將擬南芥HemA1基因啟動子控制的釀酒酵母ALA合酶基因（Hem1）的重組基因（YHem1）通過農桿菌介導法轉入草莓離體葉片中。經卡那霉素篩選，PCR和RT-PCR檢測，證明外源基因已經轉入草莓體內，獲得3株轉基因植株。葉片快速葉綠素熒光特性測定顯示，轉基因草莓葉片PSII最大光化學效率（Fv/Fm）、光合性能指數（PIABS）和捕獲的激子將電子傳遞到QA-下游的其他電子受體的概率（ψo）顯著高于野生型，而QA被還原的最大速率（Mo）則低于野生型，說明轉入YHem1基因提高了草莓葉片光合能量轉化能力。

關鍵詞： 紅頰草莓； 重組ALA合酶基因（YHem1）； 遺傳轉化； 轉基因植株； 葉綠素熒光

中圖分類號：Ｓ６６8．4 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1038－０7

Effect of transformed recombinant ALA synthase gene （YHem1） on leaf photosynthetic energy conversion in strawberry

LIN Xiao-hui， ZHANG Zhi-ping， HAN Li-xiao， WU Zhen， WANG Liang-ju*

（College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing，Jiangsu 210095 China）

Abstract: In order to breed new varieties with higher photosynthetic capacity under stress conditions， the experiments were carried out to establish regeneration system from leaf explants of Benihonppe strawberry （Fragaria ananassa Duch.） and then a recombinant gene YHem1， yeast ALA synthase gene controlled by Arabidopsis thaliana HemA1 gene promoter， was transformed into the detached leaves mediated with Agrobacterium tumefaciens. After kanamycin selection， PCR and RT-PCR detection， three plants were identified to be the transgenic plants. The chlorophyll fast fluorescence showed that the transgenic strawberry remained higher leaf maximal photochemical efficiency （Fv/Fm）， photosynthetic performance index （PIABS） and probability of a trapped exciton moving an electron into the electron transport chain beyond QA- （ψo）， while the approximate initial slope of the fluorescence transient （Mo） was lower in transgenic plants than in the wild type. This suggested that Yhem1 transformation might increase the capacity of photosynthetic energy conversion in strawberry leaves.

Key words: Benihoppe strawberry； Recombinant ALA synthase gene （YHem1）； Genetic transformation；Transgenic plants； Chlorophyll fast fluorescence

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬于小漿果類多年生草本果樹，特別適合于秋冬季設施內栽培。設施草莓已經成為許多地區冬季農業生產的特色產業，新品種、新技術的更新越來越頻繁。紅頰是日本靜岡縣農業試驗場于1999年用章姬×幸香雜交育成的優質大果型草莓新品種[1]。引入我國后，由于果實品質好，耐低溫能力強，逐漸成為我國設施草莓生產的主栽品種之一。然而，該品種不耐高溫高濕氣候條件，導致育苗期間幼苗生長困難，繁殖力低，嚴重影響該品種的生產發展。如何提高紅頰草莓耐高溫高濕能力已成為生產發展中亟待解決的關鍵問題之一。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是所有生物體內卟啉化合物生物合成的關鍵前體[2]。外源施用ALA可以增強多種作物抗低溫弱光、高溫強光、干旱、鹽漬等逆境脅迫能力，提高凈光合速率[3]。趙彩萍[4]提出，在夏秋季塑料大棚中噴布ALA可以提高重茬地西瓜幼苗抵抗夏季高溫脅迫能力。張治平等[5]將釀酒酵母菌ALA合酶（ALAS）基因（Hem1）與擬南芥HemA1啟動子[6] （一種光敏型啟動子）重組起來，構建了一個光敏啟動子控制的重組基因（YHem1）。當YHem1基因轉入到煙草、擬南芥、油菜、番茄等植物后，能顯著增強植株抗低溫、高光、鹽漬等脅迫能力，提高光化學效率和凈光合速率，促進植株生長，提高產量，并且改善品質[7]。因而，YHem1有望成為一個擁有完全自主知識產權的能夠增強植物抗逆性的功能基因。然而，利用YHem1轉化草莓培育高光合抗逆新種質的研究尚未見報道。我們以紅頰草莓試管苗為材料，在研究離體葉片組織再生基礎上，將YHem1基因轉入草莓體內，通過抗性篩選、PCR、RT-PCR檢測，獲得了3株轉基因草莓植株，并且證明，轉基因植株具有較強的光合能量轉化效率，從而為草莓抗逆新品種選育創造條件。

1 材料和方法

1.1 材料

紅頰草莓（Fragaria ananassa Duch cv. Benihoppe）無菌試管苗由南京市溧水傅家邊農業觀光園組培室提供。含有ALA合酶重組基因（YHem1）的植物表達載體的根癌農桿菌由本實驗室保存。菌株為LBA4404，載體為擬南芥光敏啟動子HemA1控制的重組基因（YHem1）雙元表達載體pYF8631[5]。

1.2 試驗方法

1.2.1 不定芽再生體系建立 以MS為基本培養基，設計TDZ 1.5 mg·L-1與IBA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1）4個處理，每培養皿接種20個葉段外植體，每處理4皿，重復4次。暗培養2周后光照培養，30 d后統計不定芽再生率，根據不定芽再生率確定適宜植物生長調節劑濃度組合。

1.2.2 重組基因轉入 將外植體切下放在含有YHem1 MS懸浮菌液（D600 nm≈0.5）中浸染，設3、4、5、6、10 min 5個時間處理，每個處理為40個受體，然后共培養。MS懸浮菌液和共培養基中添加乙酰丁香酮（AS），濃度設0、50、100、150 μmol·L-1，以研究AS濃度對轉化效率的影響。共培養3 d后轉入含卡那霉素（Km）的篩選培養基中暗培養，Km質量濃度設為10、15、20、25、30 mg·L-1。暗培養3 d后，每個處理隨機取10個外植體進行GUS組織染色，檢測GUS基因瞬時表達。篩選30 d后調查抗性不定芽再生情況，以確定適宜浸染時間、AS濃度和Km濃度。GUS基因瞬時表達檢測參照Jefferson等[8]的方法。

1.3 抗性植株PCR、RT-PCR分子檢測

采用改良CTAB法，提取草莓DNA和RNA。以草莓DNA為模板進行PCR擴增擬南芥啟動子HemA1基因和釀酒酵母Hem1基因，設質粒為陽性對照。PCR反應體系為10×PCR反應緩沖液2 μL，dNTP（各2.5 mmol·L-1）2.0 μL，Mg2+（25 mmol·L-1）1.6 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA 1 μL，Taq 酶（1 U·μL-1）1 μL，加ddH2O 至20 μL反應。參數為94 ℃預變性10 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃后延伸10 min。cDNA合成按MBI公司Ferment cDNA合成試劑盒進行，用Primer Premier 5.0軟件設計基因引物。

擬南芥HemA1基因啟動子引物為：

HemA1-F: 5’-TTACCGAAATGTAGGAATCCC-3’

HemA1-R: 5’-CCCAAAATCTCAATCTCCTCT-3’；

釀酒酵母Hem1基因引物：

Hem1-F: 5’-GATGATGTGTTCAATGAGCTAC-3’

Hem1-R: 5’-CTTGATACCACTAGAAACCTC-3’

1.4 轉基因草莓幼苗葉綠素熒光參數

待轉基因植株長至4葉1心時，選取植株中心葉外第3枚功能葉片，利用日本Konica Minolta公司SPAD-502Plus型葉綠素儀測定植株葉片葉綠素相對含量，每株系重復測定15次，取平均值；采用英國Hansatech公司生產的植物效率儀（Plant Efficiency Analysis）分別測定不同株系葉片快速葉綠素熒光參數[9]，每株系重復測定5次，取平均值，并按照前人報道的方法進行JIP-test分析[10-11]。

2 結果與分析

2.1 植物生長調節劑對葉片不定芽再生的影響

在本試驗條件下，無論IBA濃度如何，紅頰草莓葉片外植體的脫分化率均為100%，說明該草莓品種的脫分化能力較強。在未添加AgNO3條件下，1.5 mg·L-1 TDZ與0.4 mg·L-1 IBA組合培養基的再生率可達77.5%，其再生芽為2.06。如果添加1.0 mg·L-1 AgNO3，則不定芽再生頻率提高到82.5%。試驗觀察到，凡顏色嫩綠、外觀厚實（圖版-A）的葉片容易再生不定芽。葉片離體暗培養1周后，開始膨大，邊緣卷曲，變硬，切口處逐漸出現愈傷組織。暗培養2周后，愈傷組織變得致密呈團簇狀（圖版-B），出現一些細小芽點（圖版-C）。離體培養30 d后，葉片被愈傷組織覆蓋，逐漸出現叢生不定芽（圖版-C）。

2.2 浸染時間對GUS瞬時表達及不定芽再生的影響

由圖1可見，外植體浸染時間不同，GUS瞬時表達率和不定芽再生率存在差異。在本試驗中浸染5 min的GUS瞬時表達率和不定芽再生率最高，分別達17.5%和3.3%。浸染3、4或6 min的外植體也有一定的GUS瞬時表達和不定芽再生，而10 min的GUS瞬時表達率為0，而且沒有不定芽再生，說明浸染時間過長，葉片受菌液傷害重，在后期培養過程中農桿菌過度增殖，葉片褐化，細胞死亡。因此，紅頰草莓葉片轉化在菌液中浸染以5 min為宜。

2.3 Km濃度對不定芽再生的影響

由圖2可以看出，隨著Km質量濃度的升高，抗性不定芽再生率逐漸降低。當Km質量濃度為10 mg·L-1時，外植體上出現大量愈傷組織，不定芽再生率為55.4%。但GUS檢測表明，這些不定芽多數為陰性，說明Km質量濃度過低提高了假陽性機率。當Km質量濃度為20 mg·L-1時，不定芽再生率降低為15%，生長慢且畸形，但GUS檢測出現的陽性機率較高。當Km質量濃度達25或30 mg·L-1時，葉片發暗，極少出現愈傷組織，生長緩慢并逐漸萎蔫死亡。因此，20 mg·L-1可作為Km抗性篩選的適宜質量濃度。以該質量濃度篩選出的不定芽切下后轉移至較低Km培養基上，可以促進不定芽生長。

2.4 乙酰丁香酮（AS）對轉化效果的影響

在MS懸浮菌液和共培養基中加入適當濃度AS可促進外植體誘導愈傷和不定芽分化。由圖3可見，不添加AS，則葉片生長緩慢，40 d后才出現愈傷組織，不定芽再生率只有5.9%；當AS濃度為50 μmol·L-1時，可以產生少量愈傷組織，不定芽再生率約為15.8%；當AS濃度為100 μmol·L-1時，10 d后葉片邊緣開始褪色卷曲，逐漸出現愈傷組織；20 d后愈傷組織呈致密的團簇狀，不定芽再生率達28.6%。當AS濃度為150 μmol·L-1時，葉片邊緣呈褐色，基本上無愈傷出現，且不久褐化死亡。因此，100 μmol·L-1 為紅頰草莓遺傳轉化中適宜的AS濃度。

2.5 紅頰草莓抗性植株的獲得與PCR、RT-PCR檢測

在黑暗中誘導并在光下篩選培養60 d后外植體絕大多數褐化，也有少量抗性芽點出現。待抗性芽長至1~2 cm（圖版-D、E），將其切下，置于1/2MS+0.2 mg·L-1 IBA+100 mg·L-1 Carb+10 mg·L-1 Km培養基中誘導生根（圖版-F），共獲得6株抗Km幼苗。

PCR擴增結果表明（圖4-A、B），6株抗Km苗中有4株的DNA樣品擴增出與陽性對照大小一致、長度為1 804 bp的擬南芥HemA啟動子基因片段，4株擴增出與陽性對照大小一致、長度為246 bp的釀酒酵母菌Hem1基因，其中編號為3，4，5的抗性苗既包含了啟動子HemA1基因又包含了目的基因Hem1，說明這3株Km苗可能為轉YHem1基因株系，遺傳轉化率為0.2%。

將提取的總RNA反轉錄成cDNA，與YHem1基因的特異引物（246 bp）進行PCR擴增，結果顯示（圖4-C），6個抗性芽中編號3，4，5的抗性苗擴增出了250 bp左右的YHem1基因片段，說明YHem1基因能夠在這些抗性植株中轉錄表達。

2.6 不同株系草莓葉片葉綠素相對含量比較

從圖5可以看出，轉基因株系葉綠素相對含量（SPAD值）顯著高于野生型，其中，轉基因株系P3比野生型高出37%，其他2個株系比野生型高出30%，說明轉入YHem1基因提高了草莓葉片葉綠素含量。

2.7 轉基因草莓葉片葉綠素快速熒光誘導動力學分析

從圖6中可以看出，在O-J相，轉基因植株與野生型沒有明顯差異，而在J相以后，轉基因葉片的熒光強度逐漸高于野生型，特別是在P相時，轉基因草莓葉片P點熒光強度顯著高于野生型，而且不同株系間均表現出同樣趨勢，表明轉入YHem1基因能夠提高草莓葉片葉綠素熒光產額。

2.8 轉基因草莓葉片Fv/Fm、PIABS、Ψo和Mo等熒光參數比較

由圖7-A可以看出，轉基因植株PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）普遍高于野生型，其中，株系P4和P5與野生型的差異達到P=0.05顯著水平，YHem1基因轉入有利于提高草莓植株葉片 PSⅡ光化學效率。由圖7-B可以看出，轉基因株系PIABS普遍高于野生型，其中株系P4和P5與野生型的差異達到P=0.05顯著水平。從相對量上看，P5比野生型高出27%。圖7-C顯示，轉基因草莓葉片捕獲激子將電子傳遞到電子傳遞鏈QA-下游其他電子受體的概率 （Ψo） 普遍高于野生型葉片，其中，株系P5的差異達到P=0.05水平，意味著YHem1基因轉入降低了QA電子受體被關閉的速率，有利于光合電子向下游傳遞。由圖7-D可以看出，轉基因株系QA被還原的最大速率（Mo）明顯降低，說明YHem1基因轉入保護了草莓葉片PSII受體側活性。比較以上4個熒光參數，可以認為，轉基因株系P5光合能力優于P3和P4，更優于野生型。

3 討 論

有關紅頰草莓組織再生已經有一些研究報道。例如，鄭晶晶[12]提出，紅頰草莓葉片不定芽誘導以MS+TDZ 1.5 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1培養基為好，再生率可達67.8%；王翡等[13]觀察到，紅頰草莓葉片在MS+2.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 2，4-D的培養基上不定芽再生率可達79.8%。但是，董莉等[14]認為，紅頰草莓葉片在MS+TDZ 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養基上的不定芽分化率最高，可達90%，似乎NAA的誘導效果比IBA更好。柯善強等[15]提出，NAA與6-BA適當濃度組合可以誘導草莓葉片外植體形成不定芽。顯然，對于紅頰草莓組織再生的植物生長調節劑組合仍然存有爭議。本試驗結果表明，在MS + TDZ 1.5 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1培養基上紅頰葉片的再生率可達77.5%。這與鄭晶晶[12]的研究結果基本一致。此外，添加1.0 mg·L-1 AgNO3可以提高紅頰草莓葉片組織再生率，說明植物組織培養過程中乙烯可能抑制草莓葉片組織再生[16]。類似地，王翡等[13]提出，添加 8 mg·L-1 AgNO3也可以提高紅頰葉片再生率。

袁維風等[17]報道，D 600 nm為0.3~0.5的菌液浸染對草莓遺傳轉化最為適宜。在紅頰草莓上，鄭晶晶[12]研究結果支持了這一觀點，認為D 600 nm為0.3~0.5的菌液浸染有利于GUS基因瞬時表達。本試驗以D 600 nm為0.3~0.5的菌液浸泡3~10 min，發現浸染5 min的GUS瞬時表達率和不定芽再生率最高。如果浸染10 min，則因農桿菌大量滋生，外植體不能再生。

在草莓遺傳轉化中，大多采用卡那霉素作為抗性培養基篩選劑，而且濃度在20~50 mg·L-1[18-20]。本試驗結果與此相似，認為20 mg·L-1 Km是紅頰草莓遺傳轉化適宜的篩選濃度。但是，這與鄭晶晶[12]的研究結果不同。她認為，在20 mg·L-1Km培養基上，紅頰草莓葉片愈傷組織的誘導與生長幾乎完全受抑。培養45 d后，外植體逐漸白化死亡。因此認為Km以10~15 mg·L-1為好。導致這一結果的原因可能與外植體發育程度和生理狀態有關。

乙酰丁香酮（AS）等酚類化合物有利于農桿菌介導的植物遺傳轉化[17]。尹淑萍等[21]報道，100 mg·L-1AS處理草莓葉柄，轉化頻率比對照提高10%。在黃瓜遺傳轉化中，菌液和共培養基中同時使用AS，抗性芽分化率最高[22]。本試驗中，MS懸浮菌液和共培養中同時添加100 μmol·L-1 AS，不定芽再生率比對照高出4倍。利用上述植物組織再生與遺傳轉化體系，本試驗獲得了3株轉基因草莓。

葉綠素相對含量測定結果表明，轉入YHem1顯著提高了草莓葉綠素含量。這與劉衛琴等[23]使用外源ALA的研究結果一致。葉綠素快速熒光特性測定結果表明，轉基因葉片葉綠素熒光產額明顯高于野生型，而且Fv/Fm、PIABS和Ψ0等熒光參數高于野生型，M0低于野生型，說明YHem1基因轉入提高了草莓葉片PSII反應中心光合電子傳遞能力。這與外源ALA處理的甜瓜[24]、蘿卜[25]、小白菜[26]結果相似。根據前人報道和本研究獲得的初步結果，可以預期，這些轉基因草莓對環境逆境的適應性可能可以得到明顯提高。這項研究工作目前正在進行中。

4 結 論

紅頰草莓離體幼葉懸浮于MS菌液中浸染5 min，可將YHem1基因轉入草莓體內。添加100 μmol·L-1 AS有利于草莓遺傳轉化。暗培養3 d后，在MS+1.5 mg·L-1 TDZ+0.4 mg·L-1 IBA+20 mg·L-1 Km篩選培養基中獲得了6個抗性株系，其中3個為轉基因株系，而且其葉片具有更高的光化學轉化效率，表明轉化YHem基因可以提高草莓葉片光合能力。（本文圖版見封3）

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