甜櫻桃 B類MADS-box基因的分離與序列分析

摘 要：為研究MADS-box基因在甜櫻桃花發育中的作用，以甜櫻桃品種拉賓斯為試材，根據多種植物MADS-box基因保守序列設計引物，采用RT-PCR和RACE方法克隆基因cDNA全長，并用半定量PCR法研究基因在不同組織中的表達。克隆得到1個基因全長962 bp，命名為PaMADS2（GenBank登錄號：HQ229606），包含1個633 bp的開放閱讀框，編碼210個氨基酸。序列比對和進化分析表明，PaMADS2與B類的PI基因家族親緣關系最近。組織特異性分析表明PaMADS2在雄蕊和花瓣中表達。推斷所克隆的PaMADS2基因為MADS-box B類家族成員。

關鍵詞： 甜櫻桃； 花器官； 雄蕊； 花瓣； MADS-box

中圖分類號：Ｓ６６2．5 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1082－０4

Isolation and sequence analysis of B-class MADS-box gene in sweet cherry

LIN Miao-miao1， ZHAO Chang-zhu1， GU Hong1， ZHANG Hui-qin2， CHEN Jin-yong1， XIE Ming2， FANG Jin-bao1*

（1Key Laboratory for Fruit Tree Growth， Development and Quality Control， Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou，Henan 450009 China； 2Institute of Horticulture， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310021 China）

Abstract: To study the role of MADS-box genes in floral development of sweet cherry， MADS-box gene was isolated from Prunus avium L. Lapins with RT-PCR and RACE approaches. Primers were designed according to the conservative region sequences of various plant MADS-box family genes， and semi-quantitative PCR was used to analyze the expression of gene in different organs and tissues. The full length of cDNA is 962 bp， named PaMADS2 （the accession numbers in GenBank: HQ229606）， with an open reading frame （ORF） of 633 bp and encoding 210 amino acid residues. Sequence comparison and phylogenetic analysis indicated that PaMADS2 closely resembles the PI clade of class B. Tissue specific analysis showed that PaMADS2 expressed in petal and stamen. The results suggested that PaMADS2 belongs to the B-class MADS-box gene family.

Key words: Sweet cherry （Prunus avium L.）； Floral organs； Stamen； Petal； MADS box

MADS-box基因是一類編碼轉錄因子的基因家族，最先是在釀酒酵母（MCMI）、擬南芥（AG）、金魚草（DEF）和人類（SRF）中發現的，故為MADS[1-4]。在高等植物中，MADS-box基因由4個保守程度不同的區域組成，分別為M、I、K、C區域，即MIKC型MADS-box基因[5]，其按功能可分為A、B、C\\D、E 4個亞家族[6]?；ㄆ鞴僦行廴锏陌l育是由ABC模型中的B類和C類基因共同調控的[7]，而幾乎所有的B類基因都屬于MADS-box基因家族，擬南芥的B類PI基因在花瓣和雄蕊中表達，李屬中蘋果和桃也有類似報道[8-9]。

甜櫻桃在栽培過程中如在花芽分化期和花期遭遇高溫[10-13]，會使花粉發育畸形，進而影響坐果。由于甜櫻桃花具有完整的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊 4輪結構，我們采用RT-PCR和RACE方法，從甜櫻桃中分離控制其雄蕊發育的B類 MADS-box基因，并對其進行表達特征研究，為了解甜櫻桃雄蕊異常的分子機理以及MADS-box基因在雄蕊發育中的調控作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

甜櫻桃品種為6 a生拉賓斯（Prunus avium L. cv. Lapins），定植在中國農業科學院鄭州果樹研究所試驗園內。基因克隆所用材料為雌蕊分化后期的花芽。組織特異性表達分析所用的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊取自拉賓斯盛花期花朵。所有材料均用液氮處理，-80 ℃凍存備用。

1.2 甜櫻桃花芽RNA提取及cDNA合成

用改良CTAB法提取花芽RNA，用cDNA synthesis kit（MBI）合成cDNA，按照kit說明書進行。

1.3 PaMADS2基因cDNA片段的克隆

根據多種植物MADS-box基因核酸保守區，設計PCR引物擴增。PaMADS2上游引物為：5’-TAT CCACTTCATTGCTGAGGTTC-3’；PaMADS2下游引物為：5’-CAACAGCAGGTCACTTACTCTA-3’。PCR反應體系為25 μL，循環參數為:94 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s； 55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min； 34 cycles?；厥漳康钠慰寺〉絧MD19-T載體上，轉入大腸桿菌DH5ａ菌株，測序及序列分析。

使用clontech RACE kit進行5’RACE和3’RACE，PaMADS2 的3’ RACE引物序列為：5’-GGAGAGTGGAGCTGAAGAGG-3’；5’RACE引物序列為5’-GTGGCTCTTTCGCTGAAGAT-3’，按kit說明書進行操作，回收擴增產物，克隆到pMD19-T載體上，轉入大腸桿菌DH5ａ菌株，進行藍白斑篩選后進行雙向測序、拼接分別得到PaMADS2基因全長。

1.4 氨基酸序列同源性分析

通過NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov） 中Blastx對PaMADS2進行同源性搜索和比對，利用Clustal X軟件進行同源性分析，使用MEGA軟件NJ法構建系統發育樹[14]。

1.5 PaMADS2組織特異性分析

提取盛花期萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊總RNA，cDNA synthesis kit（MBI）合成cDNA，半定量分析所用引物與克隆片段引物相同。

2 結果與分析

2.1 基因分離，序列拼接與全序列分析

對雌蕊分化后期的花芽進行PCR擴增，分離出233 bp中間片段，在NCBI上Blast比對測序，結果表明該片段與多種植物的MADS-box基因有較高的同源性，證明該片段為所需的目的片段。采用RACE技術，分別獲得3’端和5’端目的片段，序列拼接得到962 bp的基因全長，命名為PaMADS2，GenBank的登錄號為HQ229606。PaMADS2基因含有1個633 bp的開放閱讀框，編碼210個氨基酸（圖1），分子量24.5 ku，等電點8.72，是一個堿性蛋白。

利用NCBI中的Blastx工具把PaMADS2核酸序列翻譯為氨基酸序列，與其他植物的PI-like MADS-box蛋白比對，結果表明，PaMADS2與ABC模型中的B類基因有較高的同源性，含有一個保守的MADS區和半保守的K區（圖2），其中與桃（Prunus persica）PrpMADS10（Genbank 登錄號：ABS32248）的同源性為97%，與蘋果MdPI（Genbank登錄號：CAC28022）的同源性為86%，與金魚草（Antirrhinum majus）GLO的同源性為63%（Genbank 登錄號：CAA48725），與擬南芥（A. thaliana）PI的同源性為57%（Genbank 登錄號：BAA06465）。

2.2 PaMADS2蛋白的系統發育分析

選擇花同源MADS-box基因的4個亞家族中的典型MADS-box基因，利用MEGA軟件，構建系統進化樹（圖3）。系統進化關系分析表明：PaMADS2基因編碼蛋白與ABC模型中的AP3/PI-like（B類）基因編碼蛋白同源性較高，其中與桃中的PpMADS10基因編碼蛋白親緣關系最近，所以把PaMADS2基因歸于AP3/PI基因亞家族。

2.3 PaMADS2組織特異性分析

半定量RT-PCR分析表明，PaMADS2基因在花瓣和雄蕊中表達，在萼片和心皮中不表達，這與同源性較高的擬南芥的PI基因的組織表達情況一致，進一步說明其應屬于B類基因（圖4）。

3 討 論

目前已經分離出大量木本植物的B類MADS-box基因[9，15]，B類MADS-box基因影響雄蕊的正常發育，但調控這些性狀的分子遺傳機制尚不十分清楚。本試驗根據MADS-box基因在M區高度保守的特征，在NCBI上搜索不同物種的MADS-box基因并進行核酸、蛋白比對以及系統進化分析，設計同源特異性引物，利用RT-PCR和RACE技術，我們克隆得到一個PaMADS2 基因，該基因具有完成的ORF以及3’-UTR和5’-UTR，推斷的蛋白質具有完整的M區和K區。

在基因表達上，PaMADS2在甜櫻桃花器官的第2輪和第3輪表達，而在第1輪和第4輪不表達，這與擬南芥的PI基因表達模式一致[16]；從系統進化分析來看，其與桃的PpMADS10、蘋果的MdPI基因親緣關系最近，所以我們推測其應屬于B類MADS-box基因家族成員。

同源性分析表明，PaMADS2與李屬的桃PpMADS10和蘋果的MdPI基因高度同源；蘋果MdPI基因能夠調控其雄蕊發育，其突變體在不授粉時由于其自身突變的MdPI不能正常表達而形成無核果實[17]。溫度可影響蘋果MdPI的表達，當MdPI轉擬南芥PI突變體后，培養溫度變化可使F2代出現輕微的花器官同源異型轉換[17]，而溫度是怎樣調控基因表達的尚不清楚。已有研究中，溫度使植物體內的赤霉素水平發生變化，而赤霉素信號轉導過程中的某些調控因子可能影響MADS-box基因的表達，所以溫度通過怎樣的途徑影響MADS-box基因的表達，有待進一步研究。

溫度可調控 MADS-box基因的表達[18]，雌雄性器官發育對溫度的要求也不同[19]，PaMADS2在不同溫度時雄蕊中的表達狀況我們將在后續的試驗中完成，以期了解PaMADS2的生物功能以及可能的調控途徑。

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