大鼠腦組織勻漿對其BMSCs向神經元樣細胞分化的影響

摘要：目的探討大鼠腦組織勻漿上清對大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)向神經元樣細胞分化的影響。方法全骨髓培養法從Wistar大鼠中分離培養BMSCs，流式細胞儀鑒定，預誘導24 h后，分為4組。空白對照組（A組）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）20 ng/mL組（B組）、bFGF 20 ng/mL+正常腦勻漿上清100 μL/mL組（C組）、bFGF 20 ng/mL+損傷腦勻漿上清100 μL/mL組（D組），誘導48 h至細胞分化。免疫細胞化學染色分別檢測各組誘導分化后神經特異性烯醇化酶（NSE）、微管相關蛋白-2（MAP-2）和膠質纖維酸性蛋白（GFAP)的表達。結果第4代BMSCs CD29、CD44和CD34的表達率為99.8%、 99.7%和2.2%；誘導后的細胞均具有神經細胞形態特征。免疫組化染色結果：NSE在誘導各組（B組、C組、D組）的表達率為44.50%、63.10%和73.30%，MAP-2的表達率為45.70%、 65.30%和 75.60%，各組均不表達GFAP。結論大鼠腦組織勻漿上清能提高BMSCs向神經細胞方向分化的陽性率，損傷腦勻漿的作用更強。

關鍵詞：骨髓間充質干細胞 細胞分化 神經元

中圖分類號：R741文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0589-02

近年來利用干細胞治療神經系統疾病越來越受到人們的關注，2001年Stocum^［1］闡述了干細胞在再生醫學領域的應用前景，隨后Daadi等^［2］移植胚胎干細胞來源的神經前體細胞治療缺血小鼠；Rpsser^［3］全面闡述了干細胞在治療神經系統變性病方面的應用。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)可分化為骨細胞、神經元細胞、神經膠質細胞、肝細胞等^［4］，由于其取材對組織損傷小，無倫理道德方面的限制，成為神經細胞移植的良好來源。本實驗探討大鼠腦組織勻漿上清對其BMSCs向神經元樣細胞分化的影響。

1材料與方法

1.1材料Wistar大鼠（山西醫科大學生理實驗室）、胎牛血清（杭州四季）L-DMEM(Hyclone)、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，PeproTech）、兔抗鼠微管相關蛋白-2（MAP-2）、神經特異性烯醇化酶（NSE）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP，博奧森)、羊抗兔二抗(博士德)、即用型SP 試劑盒(博士德)、4%多聚甲醛、PBS、3%H₂O₂、倒置顯微鏡、5%CO₂ 培養箱、酶標儀、流式細胞儀等。

1.2大鼠BMSCs的分離、培養和鑒定BMSCs采用全骨髓貼壁培養法，將細胞置于37 ℃、5% CO₂培養箱內，待細胞生長融合至70%～80%時傳代。取第4代的BMSCs，按10⁵/mL水平分5管分別加入F ITC標記的小鼠抗大鼠CD29，CD44和CD45抗體，同型F ITC標記的對照IgGI以及空白對照，經流式細胞儀檢測。

1.3腦組織勻漿制備大鼠頸椎脫臼處死取出腦組織，置于玻璃勻漿器中，按150 mg/mL加入預冷的LG-DMEM培養基研磨，2 000 r/min離心15 min，留取上清。無菌條件下過濾，-20 ℃保存備用。采用Longa 線拴法制作大鼠腦缺血再灌注模型，24 h后處死，按上述方法制作損傷勻漿上清。

1.4細胞爬片和誘導取第4代BMSCs，按10⁵/mL濃度接種于鋪有蓋玻片的六孔板內，分4組：空白對照組(A)、標準對照組(B)、正常勻漿上清組(C)和損傷勻漿上清組(D)。除A組外各組加入含1 mmol/L 和20%胎牛血清的L-DMEM培養基進行預誘導。24 h后傾去預誘導液。A組正常培養，B組加入bFGF 20 ng/mL和10%胎牛血清；C組加入bFGF 20 ng/mL+正常勻漿上清100 μL/mL，D組為bFGF 20 ng/mL+損傷勻漿上清100 μL/mL。

1.5免疫細胞化學鑒定取誘導后48 h的細胞爬片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗3 次，3% H₂O₂ 37 ℃孵育15 min消除內源性過氧化物酶活性;PBS洗3次，山羊血清室溫封閉10 min，棄血清后分別加入兔抗大鼠NSE、MAP-2、GFAP抗體，4℃過夜;PBS洗3次后加入生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min；PBS洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min;PBS洗滌，DAB 顯色。陰性對照用PBS代替一抗。

2結果

2.1大鼠骨髓MSCs 的光鏡形態與細胞鑒定培養24 h后部分細胞貼壁呈多角形，72 h全量換液后貼壁細胞增大、分裂增殖，呈梭形、紡錘形。2周左右細胞匯合至70%～80%時傳代。傳代24 h 后BMSCs 即可貼壁生長，4 d～5 d 可鋪滿瓶。傳至第3代以后，為形態均一的梭形，排列為旋渦狀、菊花狀。流式細胞術檢測CD29、CD44和CD34的表達率為99.8%、 99.7%和2.2%，說明所分離培養的細胞符合MSCs表型特征。

2.2誘導后細胞形態變化與免疫化學鑒定預誘導24 h，可見少量細胞逐漸向胞核方向收縮，加入各誘導劑后上述變化增多，有突起形成并隨時間增長。對照組細胞形態無變化。

各誘導組細胞均有部分細胞NSE 和MAP-2陽性，表現為胞漿呈棕褐色。GFAP染色后各誘導組出現極少量陽性細胞。對照組均不表達NSE、MAP-2和GFAP。從上下左右中等5個方位分別選取2個非重疊視野(×100)，計數每個視野下NSE、MAP-2、GFAP陽性細胞所占比例。詳見表1。

3討論

目前研究表明BMSCs缺乏CD14，CD34和CD45等造血譜系標志，但對CD29，CD44，CD90，CD120和CD124等均呈現陽性反應^［5］。本實驗采用流式細胞儀鑒定，結果顯示所培養的細胞符合BMSCs特征。

多種方法可誘導BMSCs向神經細胞方向分化：①化學藥物誘導，Woodbury ^［6］ 用β-巰基乙醇、二甲基亞砜等抗氧化物成功使BMSCs 分化為神經元樣細胞；②細胞因子誘導，Tropel等^［7］用bFGF，Tomita等^［8］用多種細胞因子聯合誘導BMSCs分化為神經細胞。 ③采用細胞共培養，生物性誘導劑等方法為細胞分化提供有利的微環境。BMSCs能夠分化不同類型的細胞，這種可塑性與轉錄因子和信號轉導有關^［9］。Woodbury認為BME干預了細胞內的某種信號轉導，邢瑩等^［10］研究顯示，BME可能是影響了在細胞分化過程中保守而重要的Notch通道，改變了細胞命運。bFGF的絲裂原樣作用可誘導BMSCs 向神經元分化并維持細胞的存活。本實驗使用BME預誘導，bFGF和大鼠腦組織勻漿上清作為誘導劑，成功誘導出神經元樣細胞。相比于bFGF組，加入腦勻漿上清的誘導組為BMSCs向神經細胞分化和細胞活力的維持提供了更為良好的微環境，誘導效果更佳。腦組織勻漿的這種作用可能與其分泌的多種神經生長因子有關。Chopp發現鼠勻漿與MCSs共培養體系中多種重要的神經細胞生長因子如腦源性神經營養因子、神經生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等濃度升高［ 11 ］;DNA微點陣的研究也表明上述因子的基因表達增加^［12］。損傷腦組織勻漿組誘導BMSCs分化的效果更好，可能與神經組織損傷后，機體會產生一系列的變化最終導致各種神經生長因子的分泌量明顯增加有關。

本實驗表明腦組織勻漿上清協助誘導BMSCs向神經細胞分化，但具體哪些因子以及如何發揮作用有待于進一步的研究；另一方面，大多數神經細胞的鑒定僅限于形態學，而誘導細胞的最終目的是解決患者神經損傷的問題，因此有必要從神經功能方面對其進行鑒定，這一方面尚待更深入的研究。

參考文獻：

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作者簡介:陳文超(1985—)，現為山西醫科大學第二臨床醫學院神經內科碩士研究生（郵編：030001）;劉瑞玲，現為山西醫科大學第二醫院神經內科碩士研究生；李光來(通訊作者)，工作于山西醫科大學第二醫院（郵編：030001）。

(收稿日期：2010-12-08）

(本文編輯王雅潔）