缺氧誘導因子-1α在大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中的表達

摘要：目的觀察缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中的表達規(guī)律，并探討其臨床意義。方法月桂酸鈉注射法建立Wistar大鼠血栓閉塞性脈管炎模型，ELISA法檢測造模前后血清中HIF-1α水平，免疫組化法半定量檢測造模后健側與患側肌肉組織中HIF-1α的表達，結合臨床病理探討其臨床意義。結果與術前相比，造模組大鼠術后血清中HIF-1α水平明顯升高（P<0.05）;與健側相比，患側肌肉組織中HIF-1α表達水平明顯增高（P<0.05）;隨著缺血時間延長，血清中HIF-1α及患側肌肉組織中HIF-1α表達水平呈下降趨勢。結論HIF-1α在大鼠血栓閉塞性脈管炎模型缺血骨骼肌及血清中早期高表達，并隨缺血時間延長而逐漸下降，可能在血栓閉塞性脈管炎的發(fā)生發(fā)展中起了一定的作用，并可作為血栓閉塞性脈管炎診斷分期及療效判斷的指標之一。

關鍵詞：血栓閉塞性脈管炎 缺氧誘導因子 缺血

中圖分類號：R543.4文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0593-02

Expression of HIF-1α in Rat Model with Thromboangitis Obliterans

Wang Liwei，Yang Tao，Cao Wendong，et al// Shanxi Medical University（Taiyuan 030001）

Abstract：ObjectiveTo observe the expression pattern of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) in the rat model with thromboangitis obliterans.MethodsWistar rat model with thromboangiitis obliterans were established by sodium laurate injection.Serum concentration of HIF-1α was detected by ELISA assay.HIF-1α expressions of muscle tissues were detected by semi-quantitative immunohistochemistry.ResultsCompared with pre-operation，HIF-1α serum concentration in models was significantly increased (P<0.05).The muscle tissue expression of HIF-1α in average gray value in modeling side was statistically increased compared with that in contralateral side (P<0.05).ConclusionThe expression of HIF-1α in the rat model with thromboangiitis obliterans significantly higher early and then decreased gradually.HIF-1α might play a role in the development of thromboangiitis obliterans，and it could be used as one of the clinical indicators to evaluate the thromboangiitis obliterans.

Key words：thromboangiitis obliterans；hypoxia inducible factor-1α；ischemia

血栓閉塞性脈管炎(TAO)是常見的外周血管缺血性疾病之一，以侵犯四肢血管為主的全身性非化膿性動靜脈炎性疾病^{［1，2］}。本課題旨在研究缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中的表達規(guī)律并探討其臨床意義。

1材料與方法

1.1材料與試劑Wistar大鼠35只，雄性，體重400 g～550 g，山西醫(yī)科大學生理教研室提供；月桂酸，北京市旭東化工廠；缺氧誘導因子-1α酶聯(lián)免疫試劑盒，上海西塘生物科技有限公司。缺氧誘導因子-1α免疫組化試劑盒，武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1大鼠造模及分組Wister大鼠35只，隨機分為假手術組及1 d、3 d、1周、2周、3周、4周造模組，每組5只。術前均留取血清標本，參照文獻方法稍加改進^{［3，4］}，制作大鼠血栓閉塞性脈管炎模型。術畢給予青霉素40×10⁴U腹腔注射，預防感染。按照造模時間分批處死，假手術組于4周時處死，處死前留取術后血清標本，并取左右后肢造模處周圍肌肉組織。

1.2.2血清HIF-1α檢測采用ELISA法檢測術前與術后血清中缺氧誘導因子-1α濃度，按照試劑盒說明書進行。

1.2.3組織中HIF-1α檢測免疫組化SABC法檢測各組造模側肢體血管及肌肉組織中缺氧誘導因子-1α的表達情況，健側肢體作為對照，操作按照試劑盒說明書進行。HIF-1α蛋白以細胞核或胞漿中有棕黃色顆粒為陽性，無反應為陰性，在400倍視野下采用Cooled CCD采集圖像，使用IPP軟件測量表達平均灰度值。平均灰度值范圍0～255，其值越低，蛋白表達越高，其值越高，蛋白表達越低。

1.3統(tǒng)計學處理計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。SPSS 13.0處理分析。

2結果

2.1體征變化各造模組大鼠均出現(xiàn)左后肢缺血表現(xiàn)，依造模時間增加而逐漸加重，1 d組、3 d組均有左后肢缺血、腫脹、足趾發(fā)黑表現(xiàn)。1周組缺血表現(xiàn)加重、壞死范圍擴大至踝部。2周組出現(xiàn)干性壞疽、壞死范圍至膝部，局部炎癥反應明顯，3周、4周組有壞死肢體脫落表現(xiàn)，嚴重者有肢體干性壞疽，甚至肢體脫落。組織病理切片示：炎癥反應明顯，炎癥細胞聚集，肌肉組織失去正常紋理結構，2周、3周、4周組股動脈內(nèi)可見節(jié)段性閉塞，廣泛血管內(nèi)血栓形成，并伴有大量新生毛細血管。大鼠體征變化及病理切片結果證實，大鼠血栓閉塞性脈管炎模型建立成功。

2.2血清檢測結果所有造模組大鼠術后血清HIF-1α表達均高于術前，造模1 d組、3 d組、1周組、2周組、3周組、4周組、術后血清HIF-1α表達水平分別與術前比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05），假手術組造模前后HIF-1α血清表達水平比較無統(tǒng)計學意義，各造模組術后血清HIF-1α表達在1 d組迅速升高，3 d時略降低，后逐漸下降，但均高于假手術組水平，其中1 d與3 d之間、1周與2周之間、3周與4周之間比較無統(tǒng)計學意義，其余造模組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見圖1。

圖1大鼠TAO模型血清HIF-1α

2.3免疫組化結果HIF-1α蛋白在假手術組雙側及造模組健側肌肉中低表達，造模組患側肌肉組織中高表達，各造模組患側HIF-1α蛋白表達的平均灰度值較健側均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中1 d組、3 d組平均灰度值最低，兩組間比較無統(tǒng)計學意義，較其他造模組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，1周組、2周組表達水平組間比較無統(tǒng)計學意義，較其他造模組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，3周組、4周組間比較無統(tǒng)計學意義，較其他造模組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2大鼠TAO模型肌肉組織HIF-1α表達平均灰度值

3討論

TAO是一種以中小動脈節(jié)段性、非化膿性炎癥和腔內(nèi)血栓形成特征的疾病，是青壯年肢體缺血的主要原因之一，其發(fā)病特點、病理變化和臨床特點均有別于動脈粥樣硬化和其他免疫性動脈炎，但組織的缺血缺氧是其發(fā)病機制中最重要的一環(huán)^［2］。缺氧誘導因子-1α作為目前發(fā)現(xiàn)的唯一在低氧條件下發(fā)揮作用的調(diào)控亞基，可促進多種血管生成因子的表達，促進生理及病理性血管的生成^［5-7］，組織缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。

本實驗通過建立大鼠TAO模型，初步探討HIF-1α在其發(fā)病過程中的表達規(guī)律，以期為臨床診斷治療提供簡便有效的量化指標。TAO動物模型的復制和研究是本研究的關鍵環(huán)節(jié)與基礎。TAO動物模型制作方法最早報道是Ashida^［3］采用向大鼠股動脈注射月桂酸鈉的方法。本實驗發(fā)現(xiàn)，注射后嚴格壓迫穿刺點，確認無出血之后即可縫合皮膚，無需OB膠封閉穿刺點，預實驗及正式試驗中均未發(fā)現(xiàn)實驗動物造模肢體出血及死亡現(xiàn)象，此為本實驗的改進之處。

Tarak 等^［8］ 認為，肢體對動脈阻塞作出適應性反應中，最重要的是動脈生成中，側支循環(huán)重建和血管內(nèi)血流量增加。本研究證實，大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中，缺血早期HIF-1α在血清和肌肉組織中均迅速升高，隨著病情的進展而逐漸降低，一周后表達水平與早期已有統(tǒng)計學意義，但仍高于正常，此時組織中可見新生毛細血管生成，側支循環(huán)建立，3周后血清中表達水平與正常水平已無差異，而肌肉組織中仍高于正常水平，但較早期已明顯降低。缺血早期低氧濃度促使HIF-1α高表達，促進了多種血管生成因子的表達，有利于早期小血管生成以適應缺血缺氧環(huán)境，但其中很多是病理性小血管，并伴有血栓形成，對改善組織供氧意義不大，但后期其表達持續(xù)降低，導致了VEGF等生成減少，未能生成大量有效的側支循環(huán)，導致病情加重，最終組織大量壞死，導致干性壞疽甚至肢體脫落。本實驗中3 d與一周之間的HIF-1α下降關鍵時間點及促使其降低表達的原因還有待進一步實驗研究。

目前對于TAO患者的術前診斷和手術效果評價，血管造影仍是“金標準”，但存在有創(chuàng)、價格不菲、不及時等缺點。本實驗揭示的HIF-1α表達水平變化與病情變化相關性可將其作為術前診斷及術后監(jiān)測、療效評判的簡便易行的方法之一，同時，相比較目前研究熱點中將VEGF的血管生成因子直接導入體內(nèi)的方法，HIF-1α具有易調(diào)控，副反應少等優(yōu)點，可進一步研究其表達降低的關鍵時間點，通過基因轉染等方法使其持續(xù)高表達，以促進機體建立有效的新生血管，適應缺血缺氧環(huán)境，為臨床治療TAO提供一種新的方法。

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［8］Tarak HP，Hideo KM，Clifford RW，et al.Constitutively active HIF-1α improves perfusion and arterial remodeling in an endovascular model of limb ischemia［Ｊ］.Cardiovascular Research，2005，68(1):144-154.

作者簡介：王立維（1984—），男，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學在讀碩士研究生（郵編：030001）；楊濤、曹文東、皮興濤、續(xù)慧民、郝斌（通訊作者），工作于山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院（郵編：030001）。

（收稿日期 ：2011-01-24）

（本文編輯王雅潔）